任 菲，陳軍瑩，杜 萍,2，丁 楠，趙 珊，姚德生*

(廣西醫(yī)科大學(xué) 1.附屬腫瘤醫(yī)院 婦瘤科,廣西 南寧 530021； 2.附屬民族醫(yī)院 婦科，廣西 南寧 530001)

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研究論文

宮頸癌組織miR- 574- 5p的表達(dá)及其下調(diào)后對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞的影響

任 菲1，陳軍瑩1，杜 萍1,2，丁 楠1，趙 珊1，姚德生1*

(廣西醫(yī)科大學(xué) 1.附屬腫瘤醫(yī)院 婦瘤科,廣西 南寧 530021； 2.附屬民族醫(yī)院 婦科，廣西 南寧 530001)

目的探討宮頸癌患者組織中miR- 574- 5p的表達(dá)及其下調(diào)時(shí)對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖、凋亡和遷移的影響。 方法用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定80例宮頸癌組織中miR- 574- 5p水平。將miR- 574- 5p抑制物轉(zhuǎn)染宮頸癌SiHa細(xì)胞，四甲基偶氮唑鹽比色法(MTT法)檢測(cè)細(xì)胞增殖能力，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率，Tanswell遷移實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞侵襲能力。 結(jié)果宮頸癌組織中miR- 574- 5p相對(duì)表達(dá)水平高于正常宮頸組織(P<0.05)；高表達(dá)的miR- 574- 5p與腫塊大小、臨床分期、病理分級(jí)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)(P<0.05)；轉(zhuǎn)染miR- 574- 5p抑制物組與空白組及陰性對(duì)照組相比，SiHa細(xì)胞增殖能力下降(P<0.05)；細(xì)胞凋亡率明顯增加(P<0.05)；轉(zhuǎn)染后細(xì)胞穿膜能力明顯減弱(P<0.05)。 結(jié)論miR- 574- 5p的高表達(dá)與宮頸癌的進(jìn)展有關(guān)，下調(diào)miR- 574- 5p的表達(dá)抑制了宮頸癌SiHa細(xì)胞的增殖和遷移，促進(jìn)其凋亡，有望成為宮頸癌基因治療的靶點(diǎn)。

microR- 574- 5p；宮頸癌；增殖；凋亡；遷移

MicroRNAs(miRNAs)是一組內(nèi)源性的、大小在19～25個(gè)核苷酸非編碼蛋白質(zhì)的單鏈RNA分子，廣泛存在于植物、動(dòng)物等真核生物中。MiRNA參與了動(dòng)植物的發(fā)育、器官形成、細(xì)胞增殖及凋亡等復(fù)雜的生命過(guò)程。宮頸癌是女性常見(jiàn)的惡性腫瘤，也是導(dǎo)致發(fā)展中國(guó)家婦女腫瘤相關(guān)死亡的主要原因[1]。本研究前期組織標(biāo)本及血清標(biāo)本的基因芯片結(jié)果提示miR- 574- 5p在宮頸鱗癌患者中呈高表達(dá)[2]。

1 材料與方法

1.1 組織和細(xì)胞

組織樣本選擇2011年4月至2013年5月在廣西醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院接受住院手術(shù)治療的80例患者的宮頸癌組織，患者年齡25～69歲；并選擇同期手術(shù)中正常的宮頸組織60例作為正常對(duì)照組，患者年齡33～57歲。所有初治宮頸癌患者經(jīng)手術(shù)病理診斷均為鱗狀細(xì)胞癌。本研究通過(guò)廣西腫瘤防治中心倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有組織離體10 min內(nèi)置于液氮罐中保存。宮頸癌SiHa細(xì)胞系由廣西醫(yī)科大學(xué)腫瘤實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要試劑

胎牛血清(Gibco公司)、RPMI 1640培養(yǎng)液；MTT(Amresco公司)；Annexin V-PE凋亡試劑盒(Beckman公司)；LipofectamineTM2000脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑(Invitrogen)；miRcute miRNA提取分離試劑盒(北京天根公司)；MiraMasTMKit(Bioo scientific，USA)；SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ kit(Takara)；miR- 574- 5p 抑制物及PCR引物由上海吉瑪公司合成。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 組織miRNA的提取和real-time PCR檢測(cè)miR- 574- 5p水平：取液氮保存的宮頸癌組織及正常宮頸組織標(biāo)本，按照miRcute miRNA提取分離試劑盒說(shuō)明書(shū)提取總RNA。參照MiraMasTMKit試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA, -80 ℃保存。按照SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ kit試劑盒進(jìn)行PCR反應(yīng)；同一樣本分別進(jìn)行miR- 574- 5p和U6的擴(kuò)增反應(yīng)并設(shè)3個(gè)復(fù)孔。MiR- 574- 5p上游引物：5′-TACGATGAG TGTGTGTGTGTGAGTGT-3′；內(nèi)參U6上游引物：5′-TACGAGTGCTCACTTCGGCAGC-3′,下游通用引物：5′-GTCCTTGGTGCCCGAGTG-3′。 宮頸癌組織相對(duì)于正常組織的miR- 574- 5p表達(dá)水平計(jì)算方法為2-ΔΔCt(Fold change)。

1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染：宮頸癌SiHa細(xì)胞系用含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)增殖期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。轉(zhuǎn)染前1天將對(duì)數(shù)增殖期的SiHa細(xì)胞接種于培養(yǎng)板，6孔板接種細(xì)胞3×105個(gè)/孔，96孔板接種細(xì)胞5×103個(gè)/孔。設(shè)空白對(duì)照組(control)、陰性對(duì)照組(NC)、抑制組(miR- 574- 5p抑制物)，當(dāng)細(xì)胞增殖匯合約70%時(shí)按LipofectamineTM2000 說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。

1.3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖：轉(zhuǎn)染步驟及分組同前，每組設(shè)5個(gè)復(fù)孔，另設(shè)5個(gè)對(duì)照孔調(diào)零。分別于轉(zhuǎn)染后24、48、72、96和120 h進(jìn)行檢測(cè)，加入MTT(5 g/L)繼續(xù)培養(yǎng)4 h后每孔加入0.15 mL DMSO，低速振蕩10 min后用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定各孔的吸光度值(測(cè)定波長(zhǎng)490 nm)。

1.3.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡：將細(xì)胞分為對(duì)照組1組(空白對(duì)照組)、對(duì)照組2組(transfected with lipo2000)、NC組及抑制組(miR- 574- 5p抑制物)，轉(zhuǎn)染48 h后按照Annexin V-PE試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。

1.3.5 Transwell細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)：轉(zhuǎn)染步驟及分組同前，轉(zhuǎn)染24 h后用胰蛋白酶消化細(xì)胞并取0.2 mL細(xì)胞懸液接種于24孔板Transwell小室上層，下層注入0.5 mL含20%胎牛血清1640培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)15 h后用4%多聚甲醛固定上層小室細(xì)胞30 min，吉姆薩染色20 min，100倍光鏡下隨機(jī)選取5個(gè)視野計(jì)數(shù)后取平均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 組織樣本結(jié)果

宮頸癌組織中miR- 574- 5p表達(dá)差異及其與臨床病理特征的關(guān)系：宮頸癌患者組織中miR- 574- 5p的表達(dá)水平11.16±0.03顯著高于正常人的5.67±0.02(P<0.001)。早期宮頸癌患者組織中miR- 574- 5p的表達(dá)與患者的年齡、絕經(jīng)與否無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，而與腫塊大小、病理分級(jí)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及臨床分期有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)(表1)。

2.2 細(xì)胞功能試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 MiR- 574- 5p抑制物抑制SiHa細(xì)胞增殖：在轉(zhuǎn)染miR- 574- 5p抑制物后24、48、72、96和120 h后， miR- 574- 5p抑制物組增殖能力顯著低于其他兩組(P<0.05)(表2)。

2.2.2 MiR- 574- 5p抑制物促進(jìn)SiHa細(xì)胞的凋亡：對(duì)照組1凋亡率3.5%±0.7%，對(duì)照組2凋亡率48.8%±0.5%、NC組凋亡率46.7%±1.3%、抑制劑組凋亡率81.8%±0.9%，抑制劑組凋亡率顯著高于2組對(duì)照組的48.8%與NC組的46.7%(P<0.05)(圖1)。

2.2.3 MiR- 574- 5p抑制物抑制SiHa細(xì)胞遷移：

表1 宮頸癌組織中miR- 574- 5p表達(dá)與臨床 病理特征的關(guān)系Table 1 The correlation between expression of miR- 574- 5p and its clinicopathologic feature

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with normal.

miR- 574- 5p抑制物組遷移至下室的細(xì)胞數(shù)顯著低于對(duì)照組與NC組(P<0.05)(圖2，表3)。

表2 各組細(xì)胞在不同時(shí)間點(diǎn)的吸光光度值Table 2 The A value of different time among each group SiHa ±s, n=3)

*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001 compared with control.

表3 SiHa細(xì)胞穿膜計(jì)數(shù)結(jié)果Table 3 Counting of SiHa cell through membrane(n=3)

*P<0.05 compared with control.

圖1 轉(zhuǎn)染后流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率

圖2 顯微鏡下各組穿過(guò)小室的細(xì)胞數(shù)

3 討論

宮頸癌是世界范圍常見(jiàn)的婦女生殖道腫瘤之一，其嚴(yán)重危害婦女身體健康。侵襲和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤的特征， miRNA的表達(dá)水平與腫瘤的惡性進(jìn)展有關(guān)：肺癌中高表達(dá)的miR- 10b與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)[3]；miRNA- 199a- 3p的表達(dá)水平與胃癌的侵襲性和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)[4]；血清中miRNA的表達(dá)水平與甲狀腺乳頭狀癌的腫瘤轉(zhuǎn)移分期有關(guān)[5]。

miR- 574- 5在甲狀腺癌、食管癌、結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞癌等多種類(lèi)型腫瘤中高表達(dá)[6- 7]。本研究證實(shí)了宮頸癌患者組織中miR- 574- 5p高表達(dá)，且隨著宮頸癌臨床分期的演進(jìn)而增高，提示高水平的miR- 574- 5p可能與宮頸癌發(fā)生發(fā)展有關(guān)；在病理分級(jí)低及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者組織中miR- 574- 5p的表達(dá)明顯升高，表明其可能通過(guò)調(diào)控靶基因參與信號(hào)通路，增加宮頸癌細(xì)胞的侵襲、遷移能力，發(fā)揮類(lèi)似癌基因的功能從而參與了宮頸癌惡性進(jìn)展。

MiR- 574- 5p抑制物組宮頸癌SiHa細(xì)胞增殖能力明顯降低，提示miR- 574- 5p在宮頸癌的發(fā)展中起促進(jìn)作用；轉(zhuǎn)染miR- 574- 5p抑制物的SiHa細(xì)胞凋亡顯著增加且其遷移能力較其他兩組明顯增強(qiáng)，說(shuō)明宮頸癌患者中高表達(dá)的miR- 574- 5p不但促進(jìn)SiHa細(xì)胞凋亡，而且在惡性腫瘤的轉(zhuǎn)移中也有促進(jìn)作用。MiR- 574- 5p通過(guò)與靶基因CerS1 mRNA外顯子6和7之間的固有序列靶向性結(jié)合來(lái)調(diào)節(jié)HDAC1的表達(dá)，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展[8]。也有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，miR- 574- 5p直接作用于轉(zhuǎn)錄因子Ches1，調(diào)節(jié)TLR9信號(hào)通路促進(jìn)了肺癌的發(fā)展[9]。本研究探索miR- 574- 5p不同表達(dá)水平對(duì)宮頸癌SiHa細(xì)胞的影響，接下來(lái)將通過(guò)生物信息及實(shí)驗(yàn)等進(jìn)一步尋找其靶基因，確定miR- 574- 5p對(duì)宮頸癌的具體作用機(jī)制，分析miRNA可能作為人類(lèi)抗宮頸癌治療的新靶點(diǎn)。

綜上所述，本研究證實(shí)miR- 574- 5p在宮頸癌組織中高表達(dá)，且隨腫塊增大、臨床分期增高、病理分級(jí)及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移miR- 574- 5p的表達(dá)水平升高，說(shuō)明其參與了宮頸癌惡性進(jìn)展。通過(guò)宮頸癌SiHa細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，初步探討了miR- 574- 5p對(duì)宮頸癌的影響，提示其可能作為“癌基因”參與宮頸癌的發(fā)生、發(fā)展，有望成為宮頸癌潛在的治療靶點(diǎn)及預(yù)后判斷指標(biāo)。

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Expression of miR- 574- 5p in tissue with cervical cancer and effects of down-regulating miR- 574- 5p on SiHa cell

REN Fei1, CHEN Jun-ying1, DU Ping1,2, DING Nan1, ZHAO Shan1, YAO De-sheng1*

(1.Dept. of Gynecologic Oncology，the Affiliated Cancer Hospital of Guangxi Medical University， Nanning 530021; 2.Dept. of Gynecology，the Affiliated National Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，China)

Objective To investigate the expression level of tissue miR- 574- 5p and the effects of down-regulation of miR- 574- 5p on SiHa cells.Methods The level of tissue miR- 574- 5p in 80 samples cervical cancer and 60 normal samples as controls were detected by real-time RT-PCR. Transfected the miR- 574- 5p inhibitor into SiHa cells, and detected the proliferation, the apoptotic rate and the migration of SiHa cell through MTT, the flow cytometer and Transwell experiment respectively. Results Expression levels of tissue miR- 574- 5p were significantly higher in cervical cancer than that in normal controls(P<0.001); Up-regulation expression of miR- 574- 5p had a significantly positive correlation with the International Federation of Gynecology and Obstetrics (FIGO) stage and pathological grade and lymph node metastasis (P<0.05), while it had no clear-cut correlations with the age of patients and menopausal status. After transfected the miR- 574- 5p inhibitor into SiHa cells, the proliferation and the migration were decline(P<0.05), and the apoptotic rate was raised(P<0.05). Conclusions The high expression of miR- 574- 5p in the tissue of cervical cancer may be related to the progress in the malignant cervical cancer, which is then expected to be a potential therapy of cervical cancer through the effects of transfecting miR- 574- 5p inhibitor on SiHa cells.

miR- 574- 5p; cervical cancer; proliferation; apoptotic; migration

2014- 09- 19

2014- 12- 29

國(guó)家自然科學(xué)基金(81460398); 廣西自然科學(xué)基金(2011GXNSFA018184)

1001-6325(2015)04-0458-05

R246.3

A

*通信作者(corresponding author)：yaodesheng@gxmu.edu.cn