萬凱　劉家容　陸瑩　楊煒君

摘 要 研究應(yīng)用超快速高效液相色譜儀柱后衍生熒光檢測器同時測定普通白菜中16種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留。對流動相組成、波長選擇、梯度洗脫等條件進行比較研究，建立了樣品經(jīng)乙腈提取，SPE-NH2固相萃取柱凈化，液相色譜柱后衍生分離，熒光檢測（λex=339 nm， λem=445 nm）測定，外標法定量的檢測方法。研究表明：基于液相色譜熒光檢測條件，16種農(nóng)藥殘留在0.025～1.0 mg/L濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好；檢出限0.002～0.010 mg/L；平均加標回收率73.0%～103.0%，相對標準偏差（RSD）1.5%～8.8%。該研究確定的方法具有檢測范圍廣、快速、靈敏、準確、重現(xiàn)性好、易推廣等特點。

關(guān)鍵詞 超快速高效液相色譜法 ；熒光檢測 ；氨基甲酸酯 ；農(nóng)藥殘留

分類號 S481.8

Abstract The study aims to establish a method for simultaneous determination of 16 pesticide residues which are Aldicarb-sulfoxide， Aldicarb-sulfone， oxamyl， Methomyl， Hydroxycarbofuran， toxic metabolite， Aldicarb， Tsumacide， Propoxu， Carbofuran， Carbary， XMC， Isoprocarb， Fenobcarb， Methiocarb， Thiodicarb， Promecarb in cabbage by ultra fast high performance liquid chromatograph column derivative fluorescence detector. Meanwhile， the study also aims to the comparison of the composition of mobile phase， wavelength selection， gradient elution at different levels. Samples were ectracted by acetonitrile and purified by SPE-NH2-dispersive solid phase extraction. The colleted solution was analyzed by UFLC-FLD with post-column derivation and quantified by external standard method. The wavelengths were set at 339 nm and 445 nm. The result indicates that the calibration curves of 16 pesticides showed good linear relationship in the concentration of 0.025～1.0 mg/ L with correlation coefficients greater than 0.999. The detection limits ranged from 0.002～0.010 mg/L. The recoveries ranged from 73.0%～103.0% with the relative standard deviation （RSD） range of 1.5%～8.8% . The method is characterized as wide range of detection， rapid， sensitive， accurate， repeatable and ease of deployment.

Keywords ultra fast high performance liquid chromatography （UFLC） ； fluorescence detector （FLD） ； carbamate pesticides ； pesticide residues

自20世紀70年代以來，由于氨基甲酸酯類殺蟲劑具有廣譜、高效的特點，在我國使用越來越普遍[1-3]，它是一類具有-NH（CO）O-官能團有機化合物的統(tǒng)稱，是氨基甲酸（NHaCOOH）的酯類，毒理機制是抑制昆蟲乙酰膽堿酶和羧酸酯酶的活性，造成乙酰膽堿和羧酸酯的積累，影響昆蟲正常的神經(jīng)傳導(dǎo)而致死，它是針對有機氯和有機農(nóng)藥的不足而開發(fā)的一類新型農(nóng)藥，被廣泛地應(yīng)用于糧食、蔬菜水果及經(jīng)濟作物的害蟲防治[4-5]。氨基甲酸酯類農(nóng)藥除了殺蟲作用之外，還有顯著刺激作物生長的作用，其缺點是毒性大，易發(fā)生人、畜中毒事件，其殘留對人，畜及環(huán)境可產(chǎn)生極大的危害。目前，氨基甲酸酯類農(nóng)藥的殘留分析已倍受關(guān)注。

目前，氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留檢測方法很多，有色譜法[6-8]、生物檢測法[9]、生物傳感器法[10]、免疫分析法[4]、化學(xué)計量學(xué)分析法[11]等。色譜法應(yīng)用最為廣泛，其中以液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀和液相色譜儀柱后衍生檢測應(yīng)用最為普遍。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)具有檢測靈敏度高、選擇性好的優(yōu)點，其缺點是設(shè)備價格高昂，對檢測條件要求較高，普通實驗室難以達到要求，難推廣。目前常用的液相色譜法可以高效、快速地測定氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量，但存在分析時間長、檢測項目參數(shù)少的問題，如邵金良等[12-13]用液相色譜法完成7～10種氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留時間接近30 min；毛秀紅等[14]用13種氨基甲酸酯測定方法時間在50 min以上；張帆等[15]的液相質(zhì)譜聯(lián)用法完成20種氨基甲酸酯農(nóng)藥殘留測定時間也要22 min。本研究主要基于液相色譜柱后衍生熒光檢測條件，探索同時測定16種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留的快速方法，為食品農(nóng)產(chǎn)品相關(guān)農(nóng)藥殘留檢測提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器與設(shè)備

Shimadzu 氨基甲酸酯柱后衍生系統(tǒng)（具體配置為：輸液泵LC-30AD×2和LC-20AD×2，脫氣機DGU-20A5R，自動進樣器SIL-30AC，檢測器RF-20Axs，柱溫箱CTO-20A，化學(xué)反應(yīng)箱CRB-6A，控制器CBM-20A，工作站LC-Solution）；高速勻漿機（IKA， T18 basic）；離心機（Allegra X-15R）；氮吹儀；固相萃取裝置（美國Supelco公司）。

1.1.2 試劑

16種氨基甲酸酯類農(nóng)藥標準品中殘殺威、甲硫威、滅除威、猛殺威購于德國Dr.Ehrenstorfer公司，其余農(nóng)藥標準品均來自于農(nóng)業(yè)部環(huán)境質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心（天津），純度大于99%。

乙腈、甲醇、二氯甲烷、四氫呋喃均為色譜純（Merk， Germany）； NaOH（特級，Wako公司），硼酸（Boric Acid）（特級，Wako公司），鄰苯二甲醛（O-Phthaladehyde，OPA）（色譜級，PICKERING），β-巰基丙酸（β-Mercaptopropionic acid）（純度：97%以上，株式會社同仁化學(xué)研究所）；SPE-NH2固相萃取小柱（500 mg/6 mL，島津技邇公司）；水為超純水，其它試劑均為分析純。

標準溶液：準確量取適量的上述16種標準品，用甲醇配制成質(zhì)量濃度為100 mg/L的標準儲備液，避光冷凍保存。用空白樣品基質(zhì)逐級稀釋到0.025、0.050、0.10、0.500和1.00 mg/L系列的濃度，留作標準曲線用。

一級反應(yīng)試劑：稱取1.0 g 氫氧化鈉，溶于500 mL 水中；二級衍生試劑：稱取15 mg 鄰苯二甲醛（OPA），溶于50 mL 甲醇中，得到A 液；稱取3.34 g 硼酸和0.18 g 氫氧化鈉，溶于400 mL 純水中，得到B液；將A 液和B 液混合，過濾，脫氣后加入11 μL 2-巰基丙酸，混合，使用當(dāng)天配制。所有試劑和樣品需用0.45 μm 以下濾膜過濾。

1.2 方法

1.2.1 提取與凈化

15 g樣品加入30 mL乙腈提取，高速勻漿機勻漿2 min，加入2 g氯化鈉和3 g無水硫酸鎂，漩渦混勻1 min，3 500 r/min離心5 min，取上清液5 mL，氮吹至近干。先用5 mL甲醇+二氯甲烷（5+95）混合液預(yù)淋洗固相萃取小柱，加入2 mL甲醇+二氯甲烷（5+95）混合液溶解殘渣，上樣，再用10 mL甲醇+二氯甲烷（5+95）混合液分2次洗脫，收集洗脫液，氮吹至干。加入甲醇定容至2.5 mL，過0.22 μm濾膜后供超高效液相色譜儀測定。

1.2.2 色譜條件

色譜柱：Shimadzu Shim-pack XR-ODS 75 mmL×4.6 mm I.D.，2.2 μm；流動相：A 相-水（含0.2%四氫呋喃），B 相-甲醇；流速：1.0 mL/min；柱溫：50℃；進樣量：2 μL；波長：Ex=339 nm，Em=445 nm ；一級反應(yīng)溫度100℃，流速：0.5 mL/min；二級衍生溫度50℃，流速：0.5 mL/min。梯度洗脫條件見表1。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的優(yōu)化

基于液相色譜要實現(xiàn)對16種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的分離檢測，不同農(nóng)藥種類間完全分離是本研究的重點，在綜合考慮16種農(nóng)藥的極性特點，針對流動相組成、梯度洗脫條件、檢測波長等因素進行研究，以確定適合、經(jīng)濟、友好、易推廣的條件。

2.1.1 流動相的組成

目前使用高效液相色譜-柱后衍生法測定氨基甲酸酯類農(nóng)藥的流動相主要有甲醇-水體系[16]、乙腈-水體系[12]、乙腈-甲醇-水體系[17]3種。探索應(yīng)用本試驗所選擇的色譜柱，通過不斷調(diào)整梯度洗脫條件，應(yīng)用甲醇-水體系作為流動相，最好的效果是實現(xiàn)了14種農(nóng)藥標準品的分離，其中殘殺威與克百威無法完全分離（圖1）；應(yīng)用乙腈-水流動相體系時，由于乙腈極性大，分離效果更差，其中殺線威與滅多威、殘殺威與克百威均不能完全分離；應(yīng)用乙腈-甲醇-水流動相體系，同樣無法使得殘殺威與克百威完全分離。研究表明，上述3種流動相體系中以甲醇-水體系分離效果最佳。進一步以甲醇-水體系作為流動相研究，在水中添加0.2%的四氫呋喃，可實現(xiàn)16種農(nóng)藥標準品完全分離，且能夠縮短出峰時間。根據(jù)分離情況，對流動相的洗脫條件稍作調(diào)整，最終采用甲醇-四氫呋喃水溶液體系作為流動相進行梯度洗脫，在25 min內(nèi)實現(xiàn)16種目標成分完全分離（圖2、3），比現(xiàn)行農(nóng)業(yè)行業(yè)標準NY/T 761中推薦的10種氨基甲酸酯類農(nóng)藥測定時間短，提高了檢測效率，節(jié)省試驗試劑。

2.1.2 檢測波長的選擇

目前使用液相色譜熒光檢測器測定氨基甲酸酯類農(nóng)藥主要有4種選擇，分別是檢測波長：Ex=339 nm，Em=445 nm[17-18]；Ex=330 nm，Em=465 nm[14，16，19] ；Ex=260 nm，Em=465 nm；Ex=230/330 nm，Em=425 nm。圖4為16種氨基甲酸酯類農(nóng)藥在不同檢測波長條件下的色譜圖，綜合比較了以上不同檢測波長條件下目標分析物的響應(yīng)情況，發(fā)現(xiàn)在Ex=339 nm，Em=445 nm和 Ex=330 nm，Em=465 nm波長下，16種農(nóng)藥響應(yīng)值相對較高，檢測靈敏度更高，更適于痕量殘留的檢測；在Ex=330 nm，Em=425 nm波長下，響應(yīng)值較低；在Ex=260 nm，Em=465 nm和Ex=230 nm，Em=425 nm檢測波長下，響應(yīng)值最低。最終選擇Ex=339 nm，Em=445 nm作為本實驗的檢測波長。

2.2 線性范圍和檢出限

在上述研究設(shè)定的色譜條件下，對濃度為0.025、0.050、0.10、0. 500和1.00 mg/L的標準系列溶液進行測定，建立標準曲線，在各自線性范圍內(nèi)，它們的相關(guān)系數(shù)（r2）均大于0.999。根據(jù)3倍信噪比（S/N）確定16種農(nóng)藥的檢出限（LOD），16種農(nóng)藥的線性關(guān)系、相關(guān)系數(shù)以及檢出限等結(jié)果見表2。

2.3 準確度和精密度

以不含目標化合物的普通白菜樣品為本底，分別添加3個水平（添加濃度分別為0.05、0.10及0.20 mg/L）的16種農(nóng)藥混合標準溶液，按照上述實驗方法進添加回收試驗，重復(fù)進行6次實驗，得出各農(nóng)藥的平均回收率和相對標準偏差，見表3。結(jié)果表明，16種氨基甲酸酯類農(nóng)藥的回收率在73%～103%，相對標準偏差為1.5%～8.8%，滿足農(nóng)藥殘留分析的要求。

3 討論

目前在農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測常用到農(nóng)業(yè)行業(yè)標準 NY/T 761-2008，推薦測定氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留使用的是液相色譜柱后衍生熒光法，測定10種農(nóng)藥分析時間為26 min，且流動相中甲醇比例變動幅度大，對于批量樣品檢測需要較長的平衡時間。經(jīng)典的QuEChERS法，由于前處理方法的主要優(yōu)勢是簡單快速，還無法做到基質(zhì)的完全凈化，因此在與各種精密高端檢測儀器聯(lián)用進行痕量或超痕量分析時，容易產(chǎn)生基質(zhì)效應(yīng)，影響檢測結(jié)果的準確度與可靠性，且儀器設(shè)備昂貴。本研究建立的普通白菜中16種氨基甲酸酯類農(nóng)藥殘留量的超快速高效液相色譜檢測法，實現(xiàn)了25 min內(nèi)實現(xiàn)16種氨基甲酸酯類農(nóng)藥測定，相對于NY/T761分析時間更短，甲醇用量少，甲醇比例變動幅度不超過45%，批量樣品檢測需平衡時間短，節(jié)省分析時間。與此同時，具有滿意的分離效果和檢測靈敏度、回收率、精密度和定量限滿足農(nóng)藥殘留分析的要求，測定重現(xiàn)性良好，具有檢測快速、檢測項目多、儀器設(shè)備要求不高，易在普通實驗室推廣的特點，能滿足日常檢測需求，為基層檢測機構(gòu)氨基甲酸酯類農(nóng)藥的檢測提供借鑒和參考。

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