文小艷，陳鵬，劉富華，鄭璨，韋曉蓮，侯顯良

（中國人民解放軍第一八一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室，廣西代謝性疾病研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，桂林 541002）

一、病例資料

36歲的不吸煙的男性患者，自幼年患有反復(fù)呼吸道感染?；楹?年不育，就診于中國人民解放軍第181醫(yī)院的生殖醫(yī)學(xué)部；鼻竇部CT 示鼻竇炎，胸部CT 示支氣管擴(kuò)張并感染，內(nèi)臟反位（圖1）；患者的精子數(shù)量偏多（總數(shù)59.4×106），但活動(dòng)力為零（前向運(yùn)動(dòng)與非前向運(yùn)動(dòng)精子均未見）；鼻粘膜活檢電鏡病例結(jié)果顯示：纖毛橫斷面見微管數(shù)目異常，內(nèi)外動(dòng)力臂缺失多見，且存在外周二聯(lián)體微管的內(nèi)動(dòng)力臂縮短或缺失的現(xiàn)象（圖2）。

圖1 胸部及腹部CT 照片

二、基因突變檢測

圖2 患者鼻粘膜活檢電鏡圖

為鑒定該患者的致病基因，我們采用外顯子測序技術(shù)對患者外周血單個(gè)核細(xì)胞中的DNA 序列進(jìn)行分析。（1）基因組DNA 提?。夯颊呒捌涓改傅耐庵芸鼓椿蚪MDNA 提取試劑盒（Qiagen，德國）說明書進(jìn)行。DNA 純度和濃度均在核酸定量儀（Eppendoff，德國）上檢測；（2）外顯子高通量測序：DNA 樣本送華大基因有限公司，應(yīng)用NimbleGen SeqCap EZ Human Exome Library v2.0 試 劑 盒（Roche NimbleGen，美國）制備外顯子組文庫，使用Genome Analyzer：llx（Illumina，美國）測序系統(tǒng)對外顯子組區(qū)域進(jìn)行高通量測序。整個(gè)樣品制備過程包括雜交文庫制備、雜交洗脫以及雜交后測序文庫制備，通過Genome Analyzer：llx測序系統(tǒng)獲得外顯子序列信息；（3）突變分析：使用SOAPsnp 軟件［1］檢測單核苷酸變異，使用SAMtools／GATK 軟件［1］分別檢測插入缺失，并用該軟件自帶腳本進(jìn)行簡單過濾。應(yīng)用現(xiàn)有的NCBI中單核苷酸多態(tài)性（SNP）數(shù)據(jù)庫（build135）和千人基因組計(jì)劃數(shù)據(jù)庫的資源，排除與母親樣品中不同的突變和健康人群中頻率大于1%的突變（下載自UCSC 的Common SNPs，http：／／hgdownload.soe.ucsc.edu／golden-Path／hg19／snp135Mask／），剩下的突變作為候選致病突變。共鑒定出該患者1 974個(gè)候選致病突變，包括1 670個(gè)SNPs和304個(gè)InDels。用SIFT 值評估一個(gè)氨基酸置換的預(yù)測結(jié)果，選取SIFT 值較高的突變，即有害的突變，對蛋白質(zhì)功能有較大影響。查閱文獻(xiàn)，重點(diǎn)關(guān)注纖毛蛋白基因。最終我們鑒定了該患者的基因缺陷位點(diǎn)：CCDC40基因的一個(gè)雜合子突變位點(diǎn)（NM＿001243342.1：c.2609G＞A；p.R870H）；（4）突變位點(diǎn)驗(yàn)證：使用Sanger測序分析了該CCDC40 基因的候選突變位點(diǎn)。采用Primer5.0軟件設(shè)計(jì)PCR 引物，其擴(kuò)增片段橫跨患者突變所在位點(diǎn)，上游引物序列為：5’-GAGAGACAAAACCTGGCTCACCTCT-3’，下游引物序列為：5’-ACTCACTCTGCTTCCACCAGTTGAT-3’。測序后，該突變位點(diǎn)被驗(yàn)證（圖3）。對100名正常人進(jìn)行該突變位點(diǎn)的測序分析，結(jié)果未檢測到該位點(diǎn)純合或雜合突變（結(jié)果略），排除了該突變位點(diǎn)是多態(tài)性位點(diǎn)的可能性。

圖3 CCDC40突變區(qū)域的核苷酸序列驗(yàn)證外顯子測序的結(jié)果

三、討論

人體分布有纖毛的結(jié)構(gòu)在上下呼吸道、耳咽管、輸卵管等處。正常纖毛超微結(jié)構(gòu)的橫截面由9個(gè)外周微管和2個(gè)中央微管組成，表現(xiàn)為“9＋2”的結(jié)構(gòu)，它們之間通過內(nèi)外動(dòng)力臂，連接蛋白和輪輻連接（圖4）［2-3］。在正常情況下，呼吸道粘膜上的億萬個(gè)纖毛起著“清道夫”的作用，它們朝一個(gè)方向擺動(dòng)，使吸入支氣管中的灰塵、細(xì)菌與呼吸道的細(xì)胞碎片及分泌的粘液一起排到喉頭，形成痰液咳出體外。不動(dòng)纖毛綜合癥（PCD）就是一種少見的常染色體隱性遺傳病，由于纖毛結(jié)構(gòu)異?；蚬δ墚惓Ｔ斐珊粑勒衬さ睦w毛麻痹，纖毛粘液傳輸功能障礙，繼而導(dǎo)致慢性復(fù)發(fā)性化膿性肺部炎癥，鼻竇炎和中耳炎。由于纖毛結(jié)構(gòu)缺陷的方式比較多，臨床上的表現(xiàn)輕重不一，臨床上如同時(shí)有支氣管擴(kuò)張、鼻竇炎、內(nèi)臟反位3聯(lián)征，則可診斷Kartagener綜合征。PCD 多在幼年發(fā)病，男女性發(fā)病率相同。據(jù)報(bào)道，發(fā)病率約為1∶15 000～1∶30 000［4］。但由于PCD 的漏診率較高，故實(shí)際發(fā)病率應(yīng)大于上述數(shù)字。

原發(fā)性PCD 是由于纖毛結(jié)構(gòu)和（或）功能缺陷引起多發(fā)性異常的遺傳性疾?。∕IM 244 400）。到目前為止，國內(nèi)外學(xué)者已經(jīng)鑒定了導(dǎo)致該病的21個(gè)基因（表1）［1，5-15］，這些基因大多與內(nèi)外動(dòng)力臂的結(jié)構(gòu)和功能有關(guān)［1，6，15］。有研究發(fā)現(xiàn)至少12%的PCD患者的內(nèi)動(dòng)力臂和微管排列存在異常，而該異常主要是由CCDC39和CCDC40基因突變造成的［9］。

CCDC40是進(jìn)化過程中比較保守的含有卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域的蛋白，由1 142個(gè)殘基和預(yù)測的8個(gè)卷曲結(jié)構(gòu)組成，對纖毛的運(yùn)動(dòng)至關(guān)重要。主要通過調(diào)節(jié)內(nèi)動(dòng)力臂和動(dòng)力調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合體的組裝來實(shí)現(xiàn)左右軸的形成。Becker-Heck等［13］對鼻咽深部黏膜上的纖毛進(jìn)行高速視頻顯微鏡分析，以檢測CCDC40基因突變所致PCD 患者的纖毛運(yùn)動(dòng)的臨床特征。他們發(fā)現(xiàn)所有CCDC40基因突變所致的PCD 患者的纖毛擺動(dòng)幅度顯著減小。在此基礎(chǔ)上，他們進(jìn)一步闡明了該過程的分子機(jī)理：DNALI1-containing inner dynein arms和GAS11-containing DRCs這兩個(gè)軸絲復(fù)合物的正確組裝必須在CCDC40 的參與下才能完成。人類疾病中，CCDC40基因突變所致的PCD 疾病的特征是：中心微管對發(fā)生錯(cuò)位，內(nèi)動(dòng)力臂和動(dòng)力調(diào)節(jié)蛋白復(fù)合體組裝錯(cuò)誤。另外，CCDC40基因在胚胎節(jié)點(diǎn)和中線，重要組織中特異性的表達(dá)控制左右軸的形成。在Becker-Heck等［13］的研究 中，68%的CCDC40 突 變 所 致 的PCD患者有內(nèi)臟逆位的臨床表現(xiàn)。對此，“節(jié)點(diǎn)流假說”是目前廣泛被接受的能解釋內(nèi)臟逆位現(xiàn)象的理論。

自從CCDC40基因被鑒定和發(fā)現(xiàn)其參與PCD疾病后，該基因的24個(gè)疾病相關(guān)的突變位點(diǎn)已被鑒定［9，13］。本研究通過外顯子組捕獲和第2代測序技術(shù)對1例PCD 患者進(jìn)行基因突變檢測，并用Sanger測序證實(shí)檢測結(jié)果。發(fā)現(xiàn)該患者CCDC40 基因中有一個(gè)先前未被鑒定的突變位點(diǎn)（c.2609G＞A），改變了CCDC40蛋白序列，導(dǎo)致“9＋2”纖毛的超微結(jié)構(gòu)缺陷（內(nèi)動(dòng)力臂和微管排列存在異常）。

圖4 正常纖毛超微結(jié)構(gòu)的卡通圖（A）和電鏡圖（B）［2］

表1 基因突變導(dǎo)致人類PCD 疾病

過去數(shù)十年里，有關(guān)PCD 疾病致病基因的臨床研究和動(dòng)物模型研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了很多有價(jià)值的纖毛基因。這些基因研究為纖毛的功能和結(jié)構(gòu)組裝的分子機(jī)理以及左右軸線形成理論的進(jìn)一步闡明提供了新的方向，更為開發(fā)新的方法以診斷、預(yù)防和治療PCD疾病提供契機(jī)。費(fèi)前進(jìn)等［16］對5例PCD 患者共行6個(gè)周期卵胞漿內(nèi)單精子注射（ICSI）治療，取得較好的治療結(jié)果：受精率、卵裂率和優(yōu)質(zhì)胚胎率分別為50.0%、69.2%和55.6%，2例獲得臨床妊娠，1例生化妊娠，其中1例已分娩1 健康男嬰。表明ICSI是治療PCD 伴男性不育患者的一種有效的方法。然而，纖毛的結(jié)構(gòu)過于復(fù)雜，在PCD 致病基因被完全認(rèn)識前仍有大量工作要做。

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