葉 晶 蔣能靜 劉麗霞,2 張 穩(wěn)

(1.西北民族大學(xué)生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

主要組織相容性復(fù)合體（Major histocompatibil ity complex,MHC）是脊椎動物的一個與免疫應(yīng)答和抗病性密切相關(guān)的高度多肽基因家族，其表達(dá)產(chǎn)物分布于各種細(xì)胞表面，即MHC分子的遺傳變異改變了肽編碼蛋白的結(jié)合位點，使它們能夠結(jié)合多種外來多肽；許多研究支持了這一假設(shè)，MHC基因的等位基因多樣性是由寄生蟲介導(dǎo)的平衡選擇。豬的MHC稱為SLA（豬白細(xì)胞抗原），位于豬的7號染色體上，與豬的抗病力有密切關(guān)系[1,3,4,6]。MHC分為三類基因，Ⅱ類基因控制著機體的免疫應(yīng)答與免疫調(diào)節(jié)，在該基因區(qū)域中，分為兩個次區(qū)域，即DQ、DR，主要包括DRA,DRB,DQA,DQB,DPA,DPB,DZA和DOB等，具有高度的多態(tài)性和連鎖不平衡[8,9,10]。研究發(fā)現(xiàn)SLA基因與生長、胴體品質(zhì)、肉質(zhì)以及繁殖性狀均存在一定的關(guān)聯(lián)性。目前，對SLA-DQB基因的研究主要集中在其抗病育種、生長性狀、繁殖性能方面，而研究報道的SLA-DQB多態(tài)性與豬經(jīng)濟性狀的研究多體現(xiàn)在對其血清學(xué)分析基礎(chǔ)上，從基因角度研究相對較少[2,5,7]。蘭州不同地區(qū)的豬品種因為地理位置的特殊性，表現(xiàn)出其經(jīng)濟性狀的優(yōu)異性。從抗性基因的多態(tài)性出發(fā)，建立SLA-DQB基因與蘭州不同地區(qū)商品豬的經(jīng)濟性狀之間的聯(lián)系，為進一步研究豬SLA提供理論依據(jù)，為優(yōu)育蘭州商品豬提供基礎(chǔ)分子數(shù)據(jù)信息。

1 材料與方法

1.1實驗材料及儀器

1.1.1實驗材料：分別在蘭州市區(qū)、永登縣、榆中縣最大的菜市場（同一個菜市場肉源都來自同一屠宰場）選擇白豬、黑豬、花豬豬肉組織，用冰盒帶回實驗室，放在-20℃冰箱保存。引物由大連寶生物有限公司合成；瓊脂粉購自香港柴灣基因有限責(zé)任公司；Taq酶購自北京百泰克生物技術(shù)有限公司。

1.1.2實驗儀器：基因擴增儀（96G/Y杭州朗基科學(xué)儀器有限公司制造）

1.2實驗方法

1.2.1基因組DNA提取

采用常規(guī)的苯酚-氯仿提取法及TIAN Genomic DNA Kit(血液/細(xì)胞/組織基因組DNA提取試劑盒法；從豬肉組織提取DNA并溶解于TE緩沖液，在1%瓊脂糖凝膠，100V電泳檢測后，放于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設(shè)計

采用Primer5.0引物設(shè)計軟件，根據(jù)GenBank發(fā)表的SLA-DQB基因核甘酸序列設(shè)計引物（上游引物F：CGGAATTCCCC GCAGAGGATTTCGTGTACC，下游引物R：CCGTCGTGCCTTCCTCTAT）擴增目的片段273bp。

1.2.3PCR擴增

PCR擴增采用20μL體系，各成分量：上下游引物各0.4μL，模板DNA0.8μL，滅菌ddH2O7.4μL，DNA-Taq預(yù)混酶11μL。

PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性95℃1min，變性95℃30s，退火56℃30s，延伸72℃30s,35個循環(huán)，最后延伸72℃10min.4℃保存。

1.2.4SLA-DQB測序

8種樣品各選取兩個，將其PCR擴增產(chǎn)物送至北京六合華大基因科技股份有限公司蘭州分公司測序。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取結(jié)果

將所采集的蘭州本地八種商品豬豬肉組織進行TIANGEN的TIANamp Genomic DNA Kit(血液/細(xì)胞/組織基因組DNA試劑盒)提取DNA,（該試劑盒產(chǎn)品由緩沖液GA、GB、GD、漂洗液PW、洗脫緩沖液TE、Proteinase K、吸附柱CB3、2ml收集管組成）。將所采集的蘭州本地8種商品豬豬肉組織進行多次提取DNA，進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，利用紫外成像系統(tǒng)進行拍照，從圖1中可見檢測效果較好。將DNA樣保存于-20℃冰箱，以便后續(xù)PCR擴增。

圖1、DNA檢測圖

2.2 SLA-DQB基因的PCR擴增結(jié)果

對提取的DNA樣進行目的基因的PCR擴增，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測（圖2），目的條帶清晰，無雜帶，與預(yù)期結(jié)果基本相符，片段大小為273bp左右的特異條帶。

圖2 SLA-DQB基因外顯子2的PCR擴增結(jié)果M:100bpDNA Marker

2.3目的基因的序列分析

根據(jù)GenBank公布的豬SLA-DQB基因序列登錄號為BX088590，用生物軟件中的MEGA6.06對測序結(jié)果進行分析如下圖所示。

圖3 8種蘭州商品豬堿基比對

根據(jù)上面核苷酸序列分析，8種來自蘭州、永登、榆中三個地區(qū)的商品豬的SLA-DQB基因序列，與NCBI中公布的SLA-DQB基因序列進行對比，都發(fā)生了相應(yīng)的基因突變，說明其基因序列都具有一定的差異性，也預(yù)測蘭州本地商品豬具有SLA-DQB基因多態(tài)性。豬、五指山豬、大白豬構(gòu)建進化樹，進行相關(guān)的分析，得出蘭州不同商品豬與他們的親緣關(guān)系遠(yuǎn)近。

目前，對SLA-DQB基因的研究主要集中在其生長發(fā)育、繁殖性能等方面，本研究通過對蘭州不同地區(qū)商品豬的SLA-DQB基因進行分析，為進一步研究不同地區(qū)、不同品種豬的SLA-DQB基因提供理論依據(jù)，也為蘭州地區(qū)豬場的育種工作提供依據(jù)；為評價優(yōu)質(zhì)蘭州商品豬提供信息數(shù)據(jù)。另外，本研究將蘭州商品豬SLA-DQB基因序列與蘇太豬、太湖豬、五指山豬、大白豬的同源性進行比較，為改良蘭州本地商品豬的肉質(zhì)和抗病性提供一定理論依據(jù)。

圖4 13種豬種進化樹的分析

蘭州8種本地商品豬和蘇太豬、五指山豬、太湖豬、大白豬、GenBank中公布的SLA-DQB基因序列，共13條基因序列，用MEGA6.06軟件上構(gòu)建進化樹，從進化樹分析得：這8種商品豬與蘇太豬、五指山豬、太湖豬、大白豬親緣性較遠(yuǎn)，其中蘭州白豬、永登黑豬、榆中黑豬、蘭州花豬、蘭州黑豬、永登白豬、永登花豬的遺傳距離極近，說明親緣關(guān)系很高，榆中白豬與它們遺傳距離約0.1；這8種商品豬雖與蘇太豬在同一遺傳分支上，但遺傳距離相隔1.0；五指山豬與它們親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，遺傳距離為1.36，太湖豬與大白豬在同一分支上，遺傳距離為1.15；由此得出蘭州本地商品豬具有SLA-DQB多態(tài)性研究價值。

3 討論

本研究成功克隆了蘭州不同地區(qū)商品豬SLA-DQB基因外顯子2片段，片段大小為273 bp；由MEGA6.06軟件對測序結(jié)果進行分析，得出8種商品豬的SLA-DQB基因相對于GenBank公布的SLA-DQB基因序列對比，計算8種蘭州商品豬的堿基突變率，分別為蘭州白豬7.333%、蘭州黑豬4.762%、蘭州花豬4.029%、永登白豬3.363%、永登黑豬7.333%、永登花豬5.495%、榆中白豬11.792%、榆中黑豬7.690%，由此得出蘭州本地商品豬存在差異性和突變性，也說明蘭州本地商品豬具有SLA-DQB基因多態(tài)性。通過對蘭州、永登縣、榆中縣商品豬總共8種的SLA-DQB基因序列與NCBI查找的SLA-DQB基因的蘇太豬、太湖

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