張琪，楊如月，徐蓉，嚴(yán)蓉，于佳慧，印赟，翟培珺，張盈，黃新祥

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)研究室，江蘇鎮(zhèn)江212013）

非編碼RNA AsrC對巨噬細(xì)胞中傷寒沙門菌生存能力的影響

張琪，楊如月，徐蓉，嚴(yán)蓉，于佳慧，印赟，翟培珺，張盈，黃新祥

（江蘇大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)研究室，江蘇鎮(zhèn)江212013）

目的：研究傷寒沙門菌非編碼RNA AsrC對其在巨噬細(xì)胞中生存能力的影響及機(jī)制。方法：用AsrC高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對照株分別感染巨噬細(xì)胞12，24 h，檢測傷寒沙門菌在感染細(xì)胞中的生存能力；qRT-PCR檢測asrC、rseC、rpoE mRNA的表達(dá)水平；蛋白質(zhì)印跡檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)。結(jié)果：與空質(zhì)粒對照株相比，AsrC高表達(dá)菌株感染巨噬細(xì)胞12，24 h后在巨噬細(xì)胞中的生存能力明顯下降（P均＜0.01），asrC mRNA表達(dá)水平增加（P均＜0.05），對側(cè)靶基因rseC mRNA的表達(dá)水平增高（P均＜0.05），而rpoE mRNA的表達(dá)水平無明顯變化（P＞0.05）；AsrC高表達(dá)菌株自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)與空質(zhì)粒對照株間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。結(jié)論傷寒沙門菌非編碼RNA AsrC高表達(dá)可降低其在巨噬細(xì)胞中的生存能力，可能與自噬無直接關(guān)系。

傷寒沙門菌；非編碼RNA；AsrC；胞內(nèi)生存；自噬

在沙門菌侵入過程中，巨噬細(xì)胞作為機(jī)體重要的免疫細(xì)胞迅速作出反應(yīng)，通過多種殺傷機(jī)制殺滅沙門菌；與此同時，沙門菌通過致病島2編碼的Ⅲ型分泌系統(tǒng)分泌一系列效應(yīng)蛋白發(fā)揮調(diào)節(jié)作用從而得以在巨噬細(xì)胞中存活［3］。

自噬是機(jī)體的一種正常生理機(jī)制，作為一種新的細(xì)胞程序性死亡，在胞內(nèi)病原菌感染中的作用受到廣泛關(guān)注［4］。傷寒沙門菌侵入宿主細(xì)胞后，一部分在含沙門菌的囊泡（Salmonella-containing vacuoles，SCVs）中進(jìn)行復(fù)制，一部分破壞SCVs后進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，與泛素化蛋白協(xié)同復(fù)制，還有一部分迅速被自噬系統(tǒng)識別，形成自噬溶酶體從而被殺死。損壞的SCV也有一個特殊的溶酶體修復(fù)機(jī)制，進(jìn)入其中的病原菌最終也被殺死。自噬可限制病原菌在宿主細(xì)胞中的生長和增殖，保護(hù)宿主免受病原菌的感染［5］。目前，關(guān)于自噬與胞內(nèi)病原菌感染關(guān)系的研究還比較少。

近來發(fā)現(xiàn)病原菌中許多非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）在致病過程中起重要作用［6-7］，大部分是通過與靶mRNA形成堿基配對來發(fā)揮調(diào)節(jié)作用［8-9］。最近，我們通過高通量深度測序技術(shù)在傷寒沙門菌中初步發(fā)現(xiàn)了一個順式編碼的反義RNA，長893 nt，位于rseC的互補(bǔ)鏈上，將其命名為AsrC。本文旨在研究AsrC對傷寒沙門菌胞內(nèi)生存能力的影響及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒 傷寒沙門菌野生株S.Typhi GIFU 10007由日本岐阜大學(xué)醫(yī)學(xué)院微生物學(xué)教研室饋贈，高表達(dá)載體pBAD/Myc-His A購自Invitrogen公司?？召|(zhì)粒對照株和AsrC高表達(dá)菌株由本實(shí)驗(yàn)室制備保存。

1.1.2 主要試劑 L-阿拉伯糖、DNA酶Ⅰ、RNA酶抑制劑、PrimeScript?反轉(zhuǎn)錄試劑盒、SYBR?熒光定量試劑盒均為TaKaRa公司（大連）產(chǎn)品；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；氨芐西林、慶大霉素、佛波乙酯、ECL顯色液購自Sigma公司；胎牛血清、RPMI 1640培養(yǎng)基購自Gibco公司；LC3、β-肌動蛋白抗體購自Cell Signaling公司；特異性引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

1.1.3 主要儀器 PCR擴(kuò)增儀：Mastercycler Personal（Eppendorf公司）；凝膠成像系統(tǒng)：GENE GENIUSBIO IMAGING SYSTEM；實(shí)時熒光定量PCR儀：C1000 Thermal Cycler（Bio-Rad公司）。

[14]Le Hong Hiep,Living next to the Giant: the Political Economy of Vietnam’s Relations with China under Doi Moi, Singapore: ISEAS Publishing, 2017, p.10.

1.2 方法

1.2.1 引物合成 實(shí)時定量RT-PCR（qRT-PCR）所用引物均由上海生工生物技術(shù)公司合成，相關(guān)序列見表1。

表1 qRT-PCR所用引物

1.2.2 巨噬細(xì)胞胞內(nèi)生存實(shí)驗(yàn) 將巨噬樣細(xì)胞按5×105/mL接種于24孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，加入15μL佛波乙酯稀釋液（150 ng/mL）誘導(dǎo)分化48 h，貼壁細(xì)胞即為巨噬細(xì)胞，誘導(dǎo)率約為70%。挑取AsrC高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對照株的單克隆分別接種于2 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃、250 r/min培養(yǎng)過夜；次日按1∶100轉(zhuǎn)接到20 mL新鮮LB液體培養(yǎng)基，以同樣條件培養(yǎng)細(xì)菌至對數(shù)期［D（600 nm）=0.4］；加入200μL阿拉伯糖（200 mg/mL）繼續(xù)誘導(dǎo)1 h；向細(xì)胞中加入AsrC高表達(dá)菌或空質(zhì)粒對照菌（MOI為10），3.5×105/孔，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)1 h；加入100μg/mL慶大霉素作用1 h以殺死胞外菌，PBS洗3次。一部分細(xì)胞加入0.5%Triton（v/v）裂解，反應(yīng)10 min后涂于LB平板，過夜培養(yǎng)后計(jì)算單克隆數(shù)，以T0表示基礎(chǔ)細(xì)菌吞噬水平；另一部分細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)12或24 h，以相同方法計(jì)算單克隆數(shù)，以T12或T24表示胞內(nèi)細(xì)菌增殖水平。

1.2.3 總RNA提取和反轉(zhuǎn)錄 AsrC高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對照株按照巨噬細(xì)胞胞內(nèi)生存實(shí)驗(yàn)作用細(xì)胞0，2，12 h，用Trizol法分別提取總RNA，DNA酶Ⅰ消化殘余DNA（37℃，30 min），核酸檢測儀檢測RNA，確定其濃度，取10μg RNA樣品反轉(zhuǎn)錄為cDNA。

1.2.4 qRT-PCR 以反轉(zhuǎn)錄后cDNA為模板，參照文獻(xiàn)［10］，檢測相應(yīng)基因，以5S rRNA為內(nèi)參，用于相應(yīng)基因表達(dá)水平的相對定量。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測LC3蛋白 AsrC高表達(dá)菌株和空質(zhì)粒對照株分別作用細(xì)胞1，3，5，18 h，細(xì)胞裂解液裂解，收集細(xì)胞總蛋白，核酸檢測儀檢測蛋白濃度，以相同的總蛋白量煮沸變性后進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后孵育抗體，化學(xué)發(fā)光儀曝光，檢測自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件對所有數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，兩組間均數(shù)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 巨噬細(xì)胞胞內(nèi)生存實(shí)驗(yàn)

感染細(xì)胞12，24 h后，空質(zhì)粒對照株胞內(nèi)細(xì)菌水平分別為初始水平的12.7倍，7.5倍；AsrC高表達(dá)菌株胞內(nèi)細(xì)菌水平分別為初始水平的9.8倍和5.5倍（圖1）。與空質(zhì)粒對照株相比，感染12，24 h時，AsrC高表達(dá)菌株的細(xì)菌水平明顯降低（t= 6.57，5.02，P均＜0.01）。空質(zhì)粒對照株和AsrC高表達(dá)菌株在感染細(xì)胞24 h后，胞內(nèi)細(xì)菌水平均較12 h降低（t=11.59，9.14，P均＜0.01）。結(jié)果表明，AsrC的高表達(dá)可減弱傷寒沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存和增殖能力。

圖1 傷寒沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存力比較

2.2 AsrC高表達(dá)菌株感染后巨噬細(xì)胞內(nèi)asrC mRNA的表達(dá)

將空質(zhì)粒對照株感染細(xì)胞0 h時asrC mRNA水平設(shè)為初始水平，用1表示，其感染巨噬細(xì)胞2，12 h后，asrC mRNA水平分別是初始水平的2.8和0.9倍；AsrC高表達(dá)菌株感染巨噬細(xì)胞0，2，12 h后，asrC mRNA水平分別是初始水平的5.2，3.9和3.9倍。感染0，2，12 h時，AsrC高表達(dá)菌株中asrC mRNA水平較空質(zhì)粒對照株明顯增加（t=38.26，4.17，16.45，P均＜0.05）。由此說明，AsrC的高表達(dá)在巨噬細(xì)胞內(nèi)持續(xù)發(fā)揮效應(yīng)。見圖2。

圖2 不同菌株感染后細(xì)胞內(nèi)asrC mRNA的表達(dá)水平

2.3 AsrC高表達(dá)菌株感染巨噬樣細(xì)胞后對rseC mRNA和rpoE mRNA穩(wěn)定性的影響

將空質(zhì)粒對照株感染細(xì)胞0 h時rseC mRNA水平設(shè)為初始水平，用1表示，其感染巨噬細(xì)胞2，12 h后，rseC mRNA水平分別為初始水平的0.9倍和0.7倍，AsrC高表達(dá)菌株在感染巨噬細(xì)胞0，2，12 h后rseC mRNA的水平為初始水平的2.5，2.9和2.2倍。在感染巨噬細(xì)胞0，2，12 h時，與空質(zhì)粒對照株比較，AsrC高表達(dá)菌株rseC mRNA表達(dá)明顯上調(diào)（t =25.27，32.81，11.06，P均＜0.001）。見圖3。

將空質(zhì)粒對照株感染細(xì)胞0 h時rpoE mRNA水平設(shè)為初始水平，用1表示，其感染細(xì)胞2，12 h后，rpoE mRNA水平分別為初始水平的0.89倍和0.93倍，AsrC高表達(dá)菌株在感染細(xì)胞0，2，12 h后，rpoE mRNA水平分別為初始水平的0.91，1.15，0.88倍。在感染巨噬細(xì)胞0，12 h時，空質(zhì)粒對照株rpoE mRNA表達(dá)與AsrC高表達(dá)菌株間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=1.72，0.47，P＞0.05）。在感染2 h時AsrC高表達(dá)菌株rpoE表達(dá)較空質(zhì)粒對照株上調(diào)（t=6.71，P＜0.001）。結(jié)果表明，隨著感染時間的延長，巨噬細(xì)胞內(nèi)AsrC的高表達(dá)可增加對側(cè)靶基因rseC mRNA的表達(dá)，而對rpoE mRNA的表達(dá)無明顯影響。見圖4。

圖3 不同菌株感染后細(xì)胞內(nèi)rseC mRNA的表達(dá)水平

圖4 不同菌株感染后細(xì)胞內(nèi)rpoE mRNA的表達(dá)水平

2.4 AsrC對LC3蛋白表達(dá)的影響

AsrC高表達(dá)株與空質(zhì)粒對照株在相同感染時間LC3-Ⅱ的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t1=1.41，t3=0.88，t5=2.77，t18=2.71，P均＞0.05），說明AsrC高表達(dá)后，傷寒沙門菌空質(zhì)粒對照株和AsrC高表達(dá)菌株在巨噬細(xì)胞內(nèi)生存能力的差異與自噬無相關(guān)性。見圖5。

圖5 自噬標(biāo)志蛋白LC3在不同菌株中的表達(dá)

3 討論

致病菌在受到各種環(huán)境應(yīng)激時，通過上調(diào)一系列相關(guān)的基因和調(diào)節(jié)子（包括許多非編碼RNA）的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，使得自身在千變?nèi)f化的環(huán)境中得以生存。迄今為止，已在致病菌中鑒定出許多非編碼RNA，其在基因表達(dá)調(diào)控方面起重要作用［11］。

沙門菌在感染宿主細(xì)胞過程中，會遭受低pH、營養(yǎng)缺乏和氧應(yīng)激等不同的壓力環(huán)境應(yīng)激，其通過大量復(fù)制以抵抗環(huán)境壓力而存活，此為其致病的主要途徑。本研究結(jié)果顯示，AsrC高表達(dá)菌株在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存及增殖較空質(zhì)粒對照株明顯降低，可能是沙門菌感染致部分細(xì)胞死亡并裂解，胞內(nèi)的沙門菌釋放到胞外被慶大霉素殺死所致。在巨噬細(xì)胞內(nèi)，位于致病島Ⅱ上的編碼基因的轉(zhuǎn)錄水平升高，有利于沙門菌的生存和增殖，而與鞭毛合成、趨化性、鐵轉(zhuǎn)運(yùn)系統(tǒng)有關(guān)的基因和其他一些致病島Ⅰ上的編碼基因轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)［12］。本研究結(jié)果顯示，非編碼RNA AsrC高表達(dá)可降低細(xì)菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的存活和復(fù)制。

qRT-PCR結(jié)果顯示，隨著感染時間的延長，非編碼RNA AsrC在巨噬細(xì)胞內(nèi)持續(xù)高表達(dá)，說明AsrC高表達(dá)在巨噬細(xì)胞內(nèi)持續(xù)發(fā)揮效應(yīng)。對側(cè)靶基因rseC mRNA的水平也明顯增加，表明rseC反義鏈的表達(dá)可提高rseC mRNA的穩(wěn)定性，進(jìn)而促進(jìn)翻譯。與靶mRNA結(jié)合調(diào)控目的基因的表達(dá)，是細(xì)菌小RNA發(fā)揮作用最為普遍的一種形式。其中，順式編碼的反義RNA位于靶基因的反義鏈上，通過與靶基因完全互補(bǔ)發(fā)揮作用；反式編碼的RNA位于靶基因的遠(yuǎn)端，通過與靶基因不完全的堿基配對發(fā)揮作用。有文獻(xiàn)報道，許多正義-反義配對體起正向的協(xié)同調(diào)節(jié)表達(dá)作用，反義RNA很可能參與維持順式編碼基因mRNA的穩(wěn)定［13］。本研究中小RNA AsrC的高表達(dá)可提高對側(cè)靶基因rseC mRNA的穩(wěn)定性，與以上報道的正向協(xié)同調(diào)節(jié)表達(dá)作用一致。因此，本研究中傷寒沙門菌反義RNA AsrC高表達(dá)后影響其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力很可能是rseC mRNA表達(dá)增加而引起的。

研究表明RseC高表達(dá)增加σE的轉(zhuǎn)錄活性，即RseC可正向調(diào)控σE的活性［14］。σE參與傷寒沙門菌對高滲透壓應(yīng)激和氧應(yīng)激等環(huán)境應(yīng)激的應(yīng)答，進(jìn)而啟動相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，對傷寒沙門菌的存活有重要意義［15］。由此推測，AsrC高表達(dá)降低傷寒沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力可能與σE相關(guān)。本文結(jié)果顯示，AsrC高表達(dá)對rpoE mRNA的表達(dá)無影響，只在感染2 h后有微弱上調(diào)作用，表明AsrC高表達(dá)降低傷寒沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力與σE的活性無直接關(guān)系，可能與其他生存和復(fù)制相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄變化有關(guān)。

自噬在胞內(nèi)病原菌感染中具有雙重性，一方面，自噬作為機(jī)體的非特異性免疫防御屏障的重要組成部分，活化后可有效清除病原體；另一方面，某些病原體可修飾或干擾自噬，為自身在宿主細(xì)胞內(nèi)的存活及增殖創(chuàng)造有利條件［16］。因此，我們猜測AsrC高表達(dá)降低傷寒沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力與自噬增強(qiáng)有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，空質(zhì)粒對照株與AsrC高表達(dá)株的自噬標(biāo)志蛋白LC3的表達(dá)無明顯差別，提示傷寒沙門菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力可能與自噬無關(guān)或無直接相關(guān)。

本研究發(fā)現(xiàn)傷寒沙門菌非編碼RNA AsrC高表達(dá)可降低其在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生存能力，并且AsrC高表達(dá)可增加胞內(nèi)rseC mRNA的表達(dá)水平，胞內(nèi)生存能力可能與自噬無直接相關(guān)，其生存機(jī)制有待于進(jìn)一步研究。

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Effect of non-coding RNA AsrC on the intracellular survival of Salmonella enterica serovar Typhi in macrophage

ZHANGQi，YANG Ru-yue，XU Rong，YAN Rong，YU Jia-hui，YIN Yun，ZHAIPei-jun，ZHANG Ying，HUANG Xin-xiang
（Department of Biochemistry，School of Medicine，Jiangsu University，Zhenjiang Jiangsu 212013，China）

Objective：To investigate the influence of the non-coding RNA AsrC on the intracellular survival of Salmonella enterica serover Typhi in macrophage and itsmechanism.M ethods：Themacrophages intracellular survival assay was performed in AsrC overexpressing strain and the control strain；qRT-PCR was carried out to determine the transcriptional variation of asrC，rseC，rpoE；the expression of LC3 was detected by Western blotting.Results：Compared with the control strain，infected in 12，24 h，the AsrC in overexpressing strain showed lower intracellular survival in macrophage（both P＜0.01），higher levels of asrCmRNAand rseC mRNA（P＜0.05），but had no influence on rpoE（P＞0.05）；Western blot analysis revealed that the expression of LC3 had no significant difference between AsrC overexpressing strain and the control strain（P＞0.05）.Conclusion：Overexpression of AsrC might decrease the bacterial intracellular survival in macrophage，which might not be dependent on autophagy.

Salmonella enterica serovar Typhi；non-coding RNA；AsrC；intracellular survival；autophagy

R378.22 ［文獻(xiàn)標(biāo)志碼］ A ［文章編號］ 1671-7783（2015）03-0185-05

10.13312/j.issn.1671-7783.y150070

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81371780）；國家自然基金青年科學(xué)基金資助項(xiàng)目（31400125）；江蘇省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（BK20130504）

張琪（1988—），女，碩士研究生；黃新祥（通訊作者），教授，博士生導(dǎo)師，E-mail：huxinx@ujs.edu.cn

2015-03-26 ［編輯］ 劉星星