婁遠(yuǎn)蕾，匡助才，魯友明，張愛(ài)軍，鄧志鋒,*，汪 泱,3*

(南昌大學(xué) 1.第一附屬醫(yī)院 泌尿外科研究所； 2.第二附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科， 江西 南昌 330006； 上海交通大學(xué) 附屬第六人民醫(yī)院 3.四肢顯微外科研究所； 4.神經(jīng)外科， 上海 200233)

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大鼠腦缺血后Notch分子上調(diào)調(diào)控血管新生

婁遠(yuǎn)蕾1，匡助才2，魯友明4，張愛(ài)軍4，鄧志鋒2,4*，汪 泱1,3*

(南昌大學(xué) 1.第一附屬醫(yī)院 泌尿外科研究所； 2.第二附屬醫(yī)院 神經(jīng)外科， 江西 南昌 330006； 上海交通大學(xué) 附屬第六人民醫(yī)院 3.四肢顯微外科研究所； 4.神經(jīng)外科， 上海 200233)

缺血性腦卒中是臨床常見(jiàn)疾病，腦缺血發(fā)生后，神經(jīng)細(xì)胞發(fā)生變性及壞死，可導(dǎo)致嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損，盡快恢復(fù)缺血區(qū)血供是治療缺血性腦卒中的關(guān)鍵。研究顯示腦缺血后缺血區(qū)域有代償性血管新生現(xiàn)象，它們對(duì)于增加腦缺血區(qū)血液灌注量和限制缺血半影區(qū)面積的擴(kuò)散具有積極作用[1]，揭示腦缺血后血管新生的分子機(jī)制，有助于為臨床尋找新的治療靶點(diǎn)。Notch信號(hào)通路在胚胎期血管發(fā)育和腫瘤血管形成中發(fā)揮重要作用[2]，但它是否參與調(diào)控成體腦缺血后缺血皮質(zhì)區(qū)微血管新生，尚不清楚。本研究觀察大鼠腦缺血后Notch信號(hào)分子的變化及其與缺血皮質(zhì)區(qū)血管新生的關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物和主要試劑：清潔級(jí)7～9周齡雄性SD大鼠伴質(zhì)量250～280 g [南昌大學(xué)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心SYXK(贛)2010- 0002]。Notch1抗體(CST和Millipore公司)，Hes1抗體、Ⅷ因子抗體、FITC標(biāo)記的抗羊IgG和TRITC標(biāo)記的抗兔IgG(Santa cruz公司)，ECL化學(xué)發(fā)光試劑盒(Pierce公司)。

1.2 局灶性腦缺血大鼠模型的制作及分組：參考文獻(xiàn)[3]制作大鼠大腦中動(dòng)脈栓塞缺血損傷模型。模型成功的標(biāo)志為右側(cè)出現(xiàn)Horner’s征和左側(cè)肢體神經(jīng)功能缺損。將造模成功的大鼠隨機(jī)分組，每組各5只，分別于再灌注后8 h、1和3 d 處死動(dòng)物。以假手術(shù)組作為對(duì)照組。

1.3 蛋白免疫印跡：心臟灌注后游離出腦組織，提取皮質(zhì)區(qū)組織蛋白。取30 μg總蛋白經(jīng)電泳分離后轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，分別加稀釋后大鼠抗Notch1和羊抗Hes1，4 ℃過(guò)夜。加HRP標(biāo)記的抗大鼠IgG和抗山羊IgG，室溫1 h，ECL 檢測(cè)雜交信號(hào)。以β-actin蛋白作為內(nèi)參，通過(guò)Image J 軟件對(duì)各組蛋白的表達(dá)進(jìn)行半定量分析。

1. 4 免疫熒光組織化學(xué)染色：心臟灌注、取腦和固定，以8 μm作連續(xù)冰凍切片。

分別滴加小鼠抗Notch1和兔抗Ⅷ因子，37 ℃ 2 h。加FITC標(biāo)記的羊抗小鼠IgG和TRITC標(biāo)記的?？雇肐gG，室溫1 h。PBS漂洗后50%緩沖甘油封片，熒光顯微鏡下觀察并拍照。

2 結(jié)果

2.1 缺血損傷激活腦組織Notch1分子：缺血1 d后腦組織活化Notch1蛋白(NICD)顯著上調(diào)，缺血第3天表達(dá)量進(jìn)一步升高(P<0.05)。缺血1和3 d，Notch1分子的靶基因Hes1蛋白的表達(dá)趨勢(shì)與NICD一致(P<0.05)(圖1)。

*P<0.05 compared with control圖1 腦缺血后皮質(zhì)區(qū)NICD及Hes1蛋白的表達(dá)Fig 1 Protein expression of NICD and Hes1 after cerebral ischemia

A.sham control; B.8 hours after ischemia; C.1 day after ischemia; D.3 days after ischemia

2.2 Notch信號(hào)途徑參與腦缺血后血管新生的調(diào)控：正常腦組織中Vlll因子陽(yáng)性細(xì)胞(TRITC標(biāo)記)未觀察到有NICD(FITC標(biāo)記)的表達(dá)(圖2A)，腦缺血再灌注1 d后缺血皮質(zhì)區(qū)內(nèi)有少量?jī)?nèi)皮細(xì)胞表達(dá)NICD(圖2C)，腦缺血3 d表達(dá)NICD的內(nèi)皮細(xì)胞數(shù)明顯增加(P<0.05)(圖2D)，腦缺血8 h無(wú)明顯雙染陽(yáng)性細(xì)胞(圖2B)。

3 討論

血管新生是指在原有血管的基礎(chǔ)上內(nèi)皮細(xì)胞增殖、遷移和重塑形成新血管的過(guò)程，涉及諸多生長(zhǎng)因子和信號(hào)通路分子。Notch通路主要由Notch受體、配體及靶基因組成，它決定著細(xì)胞的分化和組織的發(fā)生。當(dāng)配體與受體結(jié)合后Notch分子活化，釋放受體胞內(nèi)段活性結(jié)構(gòu)域(NICD)，啟動(dòng)Notch下游靶基因Hes1等的轉(zhuǎn)錄而發(fā)揮調(diào)控作用，Notch通路激活是血管發(fā)生和功能血管最終形成的重要調(diào)控因素[4]。

本研究顯示腦缺血后腦組織缺血皮質(zhì)區(qū)NICD蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)，提示Notch通路參與了腦缺血后的病理生理過(guò)程。本文采用免疫熒光雙重染色，觀察到腦缺血3 d缺血皮質(zhì)區(qū)血管內(nèi)皮細(xì)胞中NICD蛋白的表達(dá)較對(duì)照組顯著上調(diào)，提示Notch信號(hào)通路參與了腦缺血后血管新生過(guò)程的調(diào)控。Notch1分子靶基因Hes1蛋白在腦缺血1 d后明顯上調(diào)，缺血第3天仍有較高水平表達(dá)，表明Notch1可能通過(guò)上調(diào)其靶基因Hes1蛋白參與了腦缺血后微血管新生的調(diào)控，其具體機(jī)制還需更深入分析。

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2014- 02- 12

2014- 06- 30

國(guó)家自然科學(xué)基金(81272170，81060324);江西省教育廳基金(GJJ11311)

1001-6325(2015)01-0097-02

R743

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*通信作者(corresponding author)：wangy63cn@126.com；dengzf63@126.com