江 文，李 偉，周成斌*

(1.南方醫(yī)科大學(xué) 廣東省人民醫(yī)院 廣東省心血管病研究所， 廣東 廣州 510080;2.四川大學(xué) 華西醫(yī)院 骨科， 四川 成都 610041)

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研究論文

硝普鈉及SOD降低大鼠心肌細(xì)胞DNA蛋白激酶二聚體和Ku70/80表達(dá)

江 文1，李 偉2，周成斌1*

(1.南方醫(yī)科大學(xué) 廣東省人民醫(yī)院 廣東省心血管病研究所， 廣東 廣州 510080;2.四川大學(xué) 華西醫(yī)院 骨科， 四川 成都 610041)

目的觀察硝普鈉(SNP)及自由基清除劑超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)對(duì)大鼠心肌細(xì)胞H9C2和心肌組織DNA-PKcs和Ku70/80表達(dá)的影響。方法體外培養(yǎng)H9C2心肌細(xì)胞按SNP濃度和加入的自由基清除劑SOD和CAT濃度分組；SD大鼠隨機(jī)分為5組，每組8只，分別采用0.9%氯化鈉溶液、SNP、SNP+SOD、SNP+CAT和SNP+SOD+CAT行腹腔注射，1周后收集心肌組織。用Western blot法檢測(cè)各組細(xì)胞DNA-PKcs和Ku70/80表達(dá)，免疫組織化學(xué)法檢測(cè)DNA-PKcs和Ku70/80表達(dá)。結(jié)果心肌細(xì)胞的DNA-PKcs和Ku70/80蛋白相對(duì)表達(dá)量均隨SNP劑量增加呈遞增趨勢(shì)；加入SOD或CAT或二者合用, 均顯著降低DNA-PKcs和Ku70/80表達(dá)(P<0.05)。SNP組、SNP+SOD組、SNP+CAT組和SNP+SOD+CAT組大鼠心肌組織DNA-PKcs和Ku70/80表達(dá)水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論自由基清除劑SOD和CAT能夠通過降低心肌細(xì)胞DNA-PKcs和Ku70/80的表達(dá)拮抗NO對(duì)心肌細(xì)胞的損傷。

硝普鈉；自由基清除劑；心肌細(xì)胞；DNA依賴性蛋白激酶催化亞基；Ku70/80二聚體蛋白

DNA依賴蛋白激酶催化亞單位(catalytic subunit of the DNA-dependent protein kinase, DNA-PKcs)其與調(diào)節(jié)亞基Ku70/Ku80二聚體共同啟動(dòng)細(xì)胞非同源末端連接(non-homologous end joining, NHEJ)修復(fù)信號(hào)傳導(dǎo)，在DNA復(fù)制、基因轉(zhuǎn)錄調(diào)控和端粒結(jié)構(gòu)維持等方面發(fā)揮重要作用[1]。DNA-PKcs和Ku70/Ku80二聚體在多種病變組織內(nèi)存在異常表達(dá)，與基因組不穩(wěn)定和細(xì)胞凋亡密切相關(guān)[2- 3]。病理狀態(tài)下，脂多糖及細(xì)胞因子等能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞產(chǎn)生大量的一氧化氮(nitric oxide, NO)，發(fā)揮不良反應(yīng)，參與心肌損傷、凋亡和心臟移植后排異等病理反應(yīng)[4]。有關(guān)NO 對(duì)心肌細(xì)胞損傷修復(fù)機(jī)制的影響尚未見報(bào)道，自由基清除劑的作用也未得到驗(yàn)證。本研究在體內(nèi)外環(huán)境下NO供體硝普鈉和自由基清除劑對(duì)心肌細(xì)胞DNA-PKcs和Ku70/80蛋白表達(dá)的影響，為自由基清除劑保護(hù)心肌細(xì)胞抵抗NO損傷的機(jī)制研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

兔抗人Ku70/80單克隆抗體(Anbo公司)，小鼠抗人DNA-PKcs多克隆抗體(Abcam公司)，小鼠抗人β-actin單克隆抗體、胰蛋白酶、超氧化物歧化酶、過氧化氫酶和硝普鈉(Sigma公司)，蛋白提取液(Pierce公司)，辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔/羊抗鼠IgG、PBS(北京中杉公司)，DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清(Gibco公司)。

1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)

H9C2 心肌細(xì)胞系由南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院心研所贈(zèng)送(中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫)，用含10%胎牛血清的高糖改良Eagle培養(yǎng)基(Dulbecco’s modified eagle medium, DMEM)培養(yǎng)基，在37 ℃，體積分?jǐn)?shù)為0.05的CO2及飽和濕度的恒溫箱中孵育培養(yǎng)， 每2～3 天傳代1次。待細(xì)胞匯合至80%后，按照不同分組采用不同處理方式：一組隨機(jī)分成4個(gè)亞組, 培養(yǎng)皿中加入 SNP, 終濃度分別0、10、20和40 mmol/L; 另一組隨機(jī)分成單純 SNP組、 SNP+SOD組、SNP+ CAT組和SNP+SOD+CAT 組,其中加入SNP、SOD 和CAT的終濃度分別為 40 mmol/L、50 U/mL和50 U/mL。以上細(xì)胞均在共培養(yǎng)6 h 后，常規(guī)方法提取細(xì)胞總蛋白備行Western blot檢測(cè)。

1.3 動(dòng)物模型的建立

SD大鼠40只，雄性，體質(zhì)量150～170 g [江西中醫(yī)學(xué)院,許可證號(hào)：SCXK(贛)2010- 0001]。隨機(jī)分為5組，每組8只：對(duì)照組(0.9% NaCl溶液1.5 mL)、SNP組(40 mmol/L SNP 0.5 mL+NaCl溶液 1 mL)、SNP+SOD組(SNP 0.5 mL+50 U/mL SOD 0.5 mL+NaCl溶液0.5 mL)、SNP+ CAT組(SNP 0.5 mL+ 50 U/mL CAT 0.5 mL+NaCl溶液0.5 mL)、SNP+SOD +CAT組(各0.5 mL)。隔日1次，連續(xù)1周(共3次)，于最后1次注射后24 h處死，取心臟組織置于4%甲醛溶液保存以備免疫組織化學(xué)檢測(cè)使用。

1.4 Western blot檢測(cè)DNA-PKcs和Ku70/80蛋白表達(dá)

根據(jù)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量分別行不同濃度(8%～10%) SDS-PAGE，將分離后的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，封閉1 h，分別加入小鼠抗人DNA-PKcs多克隆抗體(1∶2 000)、兔抗人Ku70/80單克隆抗體(1∶2 000) 和小鼠抗人β-actin單克隆抗體(1∶4 000)， 4 ℃孵育過夜。TBST漂洗10 min，共4次。羊抗兔或羊抗鼠辣根過氧化物酶標(biāo)記二抗(1∶5 000)4 ℃孵育4～6 h。TBST漂洗10 min，共4次。SuperSignal West Femto敏感曝光試劑盒曝光底片，然后采用Gel-Pro analyzer 4軟件分析底片上蛋白條帶灰度值，并以β-actin作為參照，計(jì)算目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

1.5 免疫組織化學(xué)法檢測(cè)DNA-PKcs和Ku70/80蛋白表達(dá)

按照免疫組織化學(xué)一步法染色試劑盒說明書進(jìn)行操作，DNA-PKcs和Ku70/80作為特異性一抗進(jìn)行免疫組化染色(DNA-PKcs濃度1∶400; Ku70/80濃度1∶3 500)，以出現(xiàn)黃色顆粒且染色強(qiáng)度高于背景的非特異性著色細(xì)胞為陽性細(xì)胞。在高倍鏡(×200)下隨機(jī)選取5個(gè)視野，每個(gè)視野計(jì)數(shù)100個(gè)細(xì)胞，按陽性細(xì)胞數(shù)的平均百分率計(jì)分。0～5%計(jì)0分，5.1%～25%計(jì)1分，25.1%～50%計(jì)2分，50.1%～75%計(jì)3分，>75%計(jì)4分。染色強(qiáng)度按多數(shù)陽性細(xì)胞呈現(xiàn)的染色特征計(jì)分。未著色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分。免疫組化得分為陽性細(xì)胞百分率和染色強(qiáng)度的計(jì)分之積。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 H9C2細(xì)胞DNA-PKcs和Ku70/80的表達(dá)

10、20和40 mmol/L的SNP與心肌H9C2細(xì)胞共培養(yǎng)6 h后，心肌細(xì)胞的DNA-PKcs和Ku70/80蛋白相對(duì)表達(dá)量均較對(duì)照組顯著升高(圖1, 表1)。

圖1 Western blot檢測(cè)不同濃度SNP對(duì)心肌H9C2細(xì)胞DNA-PKcs和Ku70/80蛋白表達(dá)的影響Fig 1 Western blot assay shows the expression of DNA-PKcs and Ku70/80 protein in H9C2 cells treated with different concentration of SNP

groupDNA?PKcsKu70/80control11SNP(mmol/L)10128±005180±00120131±007302±01840190±006304±014

2.2 SOD和CAT對(duì)心肌H9C2細(xì)胞DNA-PKcs和Ku70/80表達(dá)的影響

SOD或CAT或二者合用, 均降低DNA-PKcs和Ku 70/80蛋白表達(dá)水平。DNA-PKcs在SNP+SOD組、SNP+CAT組和SNP+SOD+CAT組的表達(dá)均顯著低于SNP組(P<0.01)。Ku70/80在SNP+SOD組和SNP+SOD+CAT組的表達(dá)顯著低于SNP組(P<0.05)，SNP+SOD組顯著低于SNP+CAT組 (P<0.05)，SNP+SOD+CAT組顯著低于SNP+CAT組(P<0.05)(圖2, 表2)。

圖2 SNP、SOD和CAT對(duì)心肌細(xì)胞DNA-PKcs和Ku70/80蛋白表達(dá)的影響Fig 2 The expression of DNA-PKcs and Ku70/80 protein in cells treated with SNP, SNP+ SOD,SNP+CAT or SNP+SOD+CAT

groupDNA?PKcsKu70/80control11SNP130±006329±056SNP+SOD033±003128±003SNP+CAT038±005220±026SNP+SOD+CAT046±014120±005

2.3 SNP、SOD和CAT對(duì)大鼠心肌組織DNA-PKcs和Ku70/80蛋白表達(dá)的影響

DNA-PKcs蛋白表達(dá)在正常大鼠心肌組織呈陰性(圖3A)，SNP組呈強(qiáng)陽性(圖3B)，SNP+SOD組呈陽性(圖3C)，SNP+CAT組呈陽性(圖3D)，SNP+SOD+CAT組呈陽性(圖3E)。此外，SNP+SOD組、SNP+CAT組和SNP+SOD+CAT組的DNA-PKcs免疫組化得分均顯著高于正常對(duì)照組(P<0.05)，SNP+SOD組顯著低于SNP組(P<0.05)，SNP+SOD+CAT組顯著低于SNP組、SNP+SOD組和SNP+CAT組(P<0.05) (圖4)。

A.DNA-PKcs expression in control group; B.DNA-PKcs expression in SNP group; C.DNA-PKcs expression in SNP+SOD group; D.DNA-PKcs expression in SNP+CAT group; E.DNA-PKcs expression in SNP+SOD+CAT group; F.Ku70/80 expression in control group; G.Ku70/80 expression in SNP group; H.Ku70/80 expression in SNP+SOD group; I.Ku70/80 expression in SNP+CAT group; J.Ku70/80 expression in SNP+SOD+CAT group

圖3 免疫組織化學(xué)檢測(cè)SNP、SOD和CAT對(duì)心肌組織DNA-PKcs和Ku70/80蛋白表達(dá)的影響

Fig 3 Immunohistochemical staining shows DNA-PKcs and Ku70/80 expression in myocardial tissues of rats treated

with SNP, SNP+SOD,SNP+CAT or SNP+SOD+CAT (DAB staining, magnification×200 and ×400)

*P<0.05 compared with control; #P<0.05 compared with SNP

Ku70/80蛋白表達(dá)在正常大鼠心肌組織呈陰性(圖3F)，SNP組呈強(qiáng)陽性(圖3G)，SNP+SOD組呈強(qiáng)陽性(圖3H)，SNP+CAT組呈強(qiáng)陽性(圖3I)，SNP+SOD+CAT組呈陽性(圖3J)。此外，SNP組、SNP+SOD組、SNP+CAT組和SNP+SOD+CAT組的Ku70/80免疫組化得分均顯著高于對(duì)照組(P<0.0001)，SNP+SOD+CAT組得分顯著低于SNP組、SNP+SOD組和SNP+CAT組(P分別<0.001, <0.001, <0.01)(圖4)。

3 討論

過量的NO對(duì)心肌細(xì)胞產(chǎn)生不良反應(yīng)，造成心肌細(xì)胞DNA 的斷裂、損傷，甚至細(xì)胞死亡。而自由基清除劑如SOD和CAT 對(duì)此有保護(hù)作用[5- 6]。大量動(dòng)物實(shí)驗(yàn)證實(shí)了自由基清除劑具有滅活NO和抑制eNOS活性的功能，對(duì)心肌細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞大有裨益[7- 8]。

本研究發(fā)現(xiàn)，H9C2細(xì)胞DNA-PKcs和Ku70/80蛋白表達(dá)水平均隨著SNP濃度的增高而增高，說明高濃度的NO供體SNP能夠刺激心肌細(xì)胞NHEJ通路兩個(gè)關(guān)鍵啟動(dòng)因子的高表達(dá)，產(chǎn)生一個(gè)異常增強(qiáng)的易錯(cuò)修復(fù)活動(dòng)，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞的修復(fù)錯(cuò)誤和細(xì)胞凋亡等發(fā)生。自由基清除劑SOD和CAT或者二者則可以有效扼制SNP對(duì)DNA-PKcs和Ku70/80的誘導(dǎo)作用，提示SOD和CAT在一定程度上對(duì)心肌細(xì)胞對(duì)抗NO損傷起著保護(hù)作用，二者聯(lián)用時(shí)效果最好。SNP能夠誘導(dǎo)心肌細(xì)胞DNA-PKcs和Ku70/80的高表達(dá)，導(dǎo)致異常修復(fù)，與細(xì)胞致死性損傷和凋亡相關(guān)。SOD和CAT均可以減弱SNP對(duì)于DNA-PKcs的激活作用，此外，聯(lián)合使用自由基清除劑SOD和CAT能夠最好地抑制SNP對(duì)細(xì)胞NHEJ啟動(dòng)蛋白DNA-PKcs和Ku70/80的誘導(dǎo)作用，從而降低細(xì)胞發(fā)生錯(cuò)誤修復(fù)和細(xì)胞損傷加劇的發(fā)生，維持細(xì)胞穩(wěn)定和正常生理功能。

本研究結(jié)果顯示SNP能夠通過誘導(dǎo)心肌細(xì)胞的DNA-PKcs和Ku70/80的高表達(dá)，從而促使NHEJ易錯(cuò)修復(fù)活動(dòng)的異?；罨?，而SOD和CAT則可以抑制SNP的這一作用，尤以二者聯(lián)用時(shí)效果最佳。

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新聞點(diǎn)擊

做義工有助于降低高血壓風(fēng)險(xiǎn)

據(jù)英國《BBC新聞》(BBC NEWS)2013-06-19日?qǐng)?bào)道，美國《心理學(xué)和老化期刊》(Psychology and Aging Journal)近期發(fā)表一篇研究稱，樂意擔(dān)任義工與易于結(jié)交朋友者患高血壓的幾率相對(duì)較低。

全美國總計(jì)有1 164名年齡在51～ 91歲的老年人參與這項(xiàng)研究調(diào)查，回答有關(guān)從事義工活動(dòng)的問題。結(jié)果顯示從事義工年逾200 h的人，得到高血壓的風(fēng)險(xiǎn)減少40%，這表示義工活動(dòng)可作為服藥控制高血壓的替代方案。

在英國，每年估計(jì)有62 000人因高血壓造成中風(fēng)及心臟病發(fā)致死的案例，此外，抑郁癥及孤獨(dú)被認(rèn)為是造成老年人經(jīng)常跌倒及得到老年癡呆癥的原因。

主持本項(xiàng)研究的賓州卡內(nèi)基·梅隆大學(xué)教授謝爾頓斯尼德(Sheldon Sneed)表示，人們習(xí)慣以避免負(fù)面生活形式(如不良的飲食習(xí)慣和缺乏運(yùn)動(dòng)的方式)，來降低得到高血壓的風(fēng)險(xiǎn)；而這項(xiàng)研究則是提供老年人以積極的正能量生活方式維持健康及成功老化的參考。

謝爾頓教授認(rèn)為，已有確鑿的實(shí)證顯示，良好的社會(huì)關(guān)系是促進(jìn)健康老化以及減少不利健康風(fēng)險(xiǎn)的重要因素。

Sodium nitroprusside and SOD decrease the expression of DNA-PKcs and Ku70/80 of rats cardiomyocytes

JIANG Wen1, LI Wei2, ZHOU Cheng-bin1*

(1.Guangdong Cardiovascular Institute, Southern Medical University, Guangzhou 510080; 2.Dept. of Orthopedics, West China Hospital of Sichuan University, Chengdu 610041, China)

Objective To determine the effects of Sodium Nitroprusside (SNP), superoxide dismutase (SOD) and catalase (CAT) on the expression of catalytic subunit of the DNA-dependent protein kinase (DNA-PKcs) and Ku70/80 heterodimer in cardiomycyte H9C2, as well as their expression in the myocardial tissues of SD rats. Methods H9C2 cells were co-cultured with SNP at concentreations of 10, 20 and 40 mmol/L for 6 hours, SD rats were injected with normal saline, SNP, SNP+SOD, SNP+CAT or SNP+SOD+CAT. Western blot and immunohistochemistry assay were used to examine DNA-PKcs and Ku70/80 protein expression respectively. Results The expression of DNA-PKcs and Ku70/80 increased in H9C2 cells co-cultured with SNP when compared with control group, but they were be decreased when treated with SOD or/and CAT. The expression of DNA-Pkcs and Ku70/80 in myocardial tissues of experimental groups were higher than the control. Conclusions Radical scavengers may

play a role as a protective effect for sodium nitroprusside related injury in cardiac myocytes.

sodium nitroprusside; radical scavengers; cardiomycyte; catalytic subunit of DNA-dependent protein kinase; Ku70/80 heterodimer

2014- 05- 08

2014- 10- 08

1001-6325(2015)01-0074-05

R3

A

*通信作者(corresponding author)：zcbwwww@163.com