吳建波，吳秀燕，胡繼芬

(福建醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，福建 福州 350005)

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研究論文

HMGB1、TLR4和NF-B在子癇前期患者胎盤組織及血漿中升高

吳建波，吳秀燕，胡繼芬*

(福建醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 婦產(chǎn)科，福建 福州 350005)

目的探討高遷移率族蛋白(HMGB1)、TOLL受體4(TLR4)和NF-B信號通路在子癇前期中的相關(guān)作用。方法輕度子癇前期患者10例、重度子癇前期患者20例和同期正常妊娠者30例。免疫組織化學(xué)(SP法)檢測胎盤中HMGB1、TLR4和NF-κB P65蛋白的表達(dá)變化及在組織中的定性、定位；用ELISA法檢測血清中HMGB1、TLR4和NF-κB P65蛋白濃度。結(jié)果子癇前期患者胎盤中HMGB1、TLR4、和NF-κB P65蛋白表達(dá)高于正常對照組 (P<0.05)；輕度和重度子癇前期患者間無差異。子癇前期患者血清中HMGB1、TLR4和NF-κB P65的含量較正常組明顯升高(P<0.05)；且重度子癇前期患者血清中HMGB1、TLR4、和NF-κB P65蛋白表達(dá)高于輕度子癇前期患者(P<0.05)。結(jié)論HMGB1、TLR4及NF-κB P65蛋白表達(dá)水平在子癇前期患者胎盤及血清中顯著升高，可能參與了子癇的發(fā)病過程。

子癇前期；炎性反應(yīng)；高遷移率組蛋白；TOLL受體4；核轉(zhuǎn)錄因子

子癇前期(preeclampsia, PE)是妊娠特有多系統(tǒng)受累的疾病，目前發(fā)病機(jī)制尚不清楚，是導(dǎo)致孕產(chǎn)婦和圍產(chǎn)兒死亡的主要原因之一。近年來研究顯示子癇前期母體對妊娠發(fā)生過度炎性反應(yīng)，使母胎界面免疫平衡失調(diào)，導(dǎo)致胎盤血管病變、血管內(nèi)皮損傷、滋養(yǎng)細(xì)胞的遷移受限、淺著床[1]。高遷移率族蛋白(highmobilitygroupbox1, HMGBl)在細(xì)胞外可刺激單核細(xì)胞產(chǎn)生TNF-α、IL- 1、IL- 6等多種炎性因子，并誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)多種黏附分子和單核細(xì)胞趨化蛋白- 1，被認(rèn)為是一種作用廣泛的促炎因子[2]。本實(shí)驗(yàn)旨在探討HMGB1與子癇前期的關(guān)系及下游的信號通路，可為子癇前期的防治提供新的思路和治療靶點(diǎn)。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2011年10月至2013年3月在福建醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院選擇行剖宮產(chǎn)手術(shù)終止妊娠的孕婦60例，分為輕度子癇前期組10例、重度子癇前期組20例和對照組30例，均無內(nèi)外科合并癥病史，其診斷標(biāo)準(zhǔn)依照樂杰主編的第七版婦產(chǎn)科學(xué)。正常妊娠組平均年齡(28.5±3.6)歲，平均孕周(39.6±1.1)周，平均新生兒體質(zhì)量(3.4±0.4)kg，輕度子癇前期組平均年齡(29.6±4.0)歲，平均孕周(38.8±1.1)周，平均新生兒體質(zhì)量(3.3±0.0.4)kg，重度子癇前期組平均年齡(27.6±5.3)歲，平均孕周(37.6±3.4)周，平均新生兒體質(zhì)量(2.7±0.6)kg。所有患者組織標(biāo)本獲取經(jīng)患者簽署知情同意書后進(jìn)行。

1.2 試劑

酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(IBL公司)； 鼠抗人HMGB1、TLR4和NF-κB P65單克隆抗體(均cell signaling-CST公司)。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集 在分娩前清晨空腹抽取外周肘靜脈血2 mL，靜置，1 000 r/min離心10 min后分離血清，分裝入高壓處理后的1.5 mL離心管后置于-70 ℃冰箱保存以備批量待檢。胎盤標(biāo)本均在剖宮產(chǎn)術(shù)后娩出胎盤后直視下取近臍帶附著處母體面(避開梗死、機(jī)化及鈣化區(qū))的全層胎盤組織，大小約1.0 cm×1.0 cm×1.0 cm，用0.9%氯化鈉注射液反復(fù)漂洗后置入10%中性多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋，制成2.5 μm厚的切片。

1.3.2 用ELISA檢測血清中HMGB1、TLR4和NF-κB P65蛋白濃度：應(yīng)用美國雷杜酶標(biāo)儀(RT-6100型)測定樣本的A值。在 Curve Expert1.4工作表中，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線：以標(biāo)準(zhǔn)品濃度作橫坐標(biāo)，對應(yīng)A值作縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)品線性回歸曲線，按曲線方程計(jì)算各樣本濃度值，再乘以2倍數(shù)，即為樣本濃度。

1.3.3 免疫組織化學(xué)檢測胎盤中HMGB1、TLR4、NF-κB P65蛋白表達(dá)：采用ELISA方法檢測血清中HMGB1、TLR4和NF-κB P65蛋白濃度，及免疫組織化學(xué)(SP法)檢測胎盤HMGB1、TLR4和NF-κB P65蛋白的表達(dá)變化及在組織中的定性、定位。光學(xué)顯微鏡下觀察各組胎盤組織中HMGB1、TLR4和NF-κB P65的表達(dá)。評分標(biāo)準(zhǔn)按Shimizu方法。對每張切片陽性細(xì)胞的陽性強(qiáng)度按無著色、淡黃色、棕黃色和棕褐色分別記0、1、2、3分；陽性細(xì)胞百分率評分：無陽性細(xì)胞0計(jì)分， <25% 計(jì)1分，25%～50% 計(jì)2分，>50% 計(jì)3分； 0～2分視為(-)，3～6分視為(+)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 孕婦血清中HMGB1、TLR4和NF-κB P65蛋白濃度

子癇前期組血清HMGB1、TLR4和NF-κB P65含量高于對照組(P<0.05)，重度高于輕度患者(P<0.05)(表1)。

2.2 血清NF-κB P65、TLR4及HMGB1的相關(guān)性

血清中NF-κB p65表達(dá)水平與TLR4存在正相關(guān)(P<0.05)(圖1A)； HMGB1表達(dá)水平與TLR4存在呈正相關(guān)(P<0.05)(圖1B)；HMGB1與NF-κB P65存在正相關(guān)(P<0.05)(圖1C)。

表1 3組血清中HMGB1、TLR4與NF-κB P65含量的比較

*P<0.01 compared with the control group；△P<0.05 compared with the MP group.

2.3 孕婦胎盤組織中HMGB1、TLR4和NF-κB P65蛋白的特點(diǎn)

正常妊娠組HMGB1主要表達(dá)于胎盤組織滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、少量間質(zhì)細(xì)胞的胞核，HMGB1在輕度子癇前期組及重度子癇前期組胎盤組織滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、少量間質(zhì)細(xì)胞的胞核及胞質(zhì)表達(dá)(圖2)；TLR4、NF-κB P65蛋白均主要表達(dá)于胎盤組織滋養(yǎng)細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、少量間質(zhì)細(xì)胞的胞質(zhì)及胞膜(圖3,4)。

圖1 血清NF-κB P65、TLR4及HMGB1的相關(guān)性Fig 1 The correlation among NF-κB P65、TLR4 and HMGB1

A.normal pregnancy group；B.mild preeclampsia group；C.severe preeclampsia group

A.normal pregnancy group；B.mild preeclampsia group；C.severe preeclampsia group

A.normal pregnancy group；B.mild preeclampsia group；C.severe preeclampsia group

groupnHMGB1TLR4NF?κBP65-+-+-+control3025(833)5(167)23(767)7(233)26(867)4(133)MP103(333)7(667)?2(200)8(800)?2(200)8(800)?SP204(200)16(800)?5(250)15(750)?3(150)17(850)?

*P<0.05 compared with control.

2.4 孕婦胎盤組織中HMGB1、TLR4和NF-κB P65蛋白的表達(dá)變化

子癇前期患者組胎盤HMGB1、TLR4和NF-κB P65蛋白表達(dá)均較正常對照組明顯增強(qiáng)， (P<0.05) (表2)。

3 討論

在培養(yǎng)的人微血管內(nèi)皮細(xì)胞中，添加的HMGB1可誘導(dǎo)黏附分子ICAM-l，VCAM- 1的表達(dá)以及腫瘤壞死因子，IL- 8，MCP- 1，PAI-l和tPA的釋放，增加中性粒細(xì)胞黏附，炎性反應(yīng)，纖溶調(diào)節(jié)[3]。核蛋白HMGB1一旦釋放細(xì)胞外就會(huì)促進(jìn)炎性反應(yīng)，HMGB1通過TLR4信號以氧化還原依賴的方式誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子，除了其氧化還原和內(nèi)源性細(xì)胞因子誘導(dǎo)的功能外，HMGB1還可以與某些炎性介質(zhì)相互作用形成強(qiáng)烈免疫刺激復(fù)合物[4]。 收集正常妊娠組和子癇前期組孕婦的血漿和胎盤，子癇前期患者胎盤HMGB1的表達(dá)明顯高于正常婦女[5]；但通過ELISA分析發(fā)現(xiàn)，子癇前期患者血漿的HMGB1與正常婦女沒有顯著差異，這說明由HMGB1引發(fā)的炎性反應(yīng)可能參與了胎盤炎性反應(yīng)過程。這說明 HMGB1作為炎性危險(xiǎn)信號在子癇前期的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮了重要作用。

TLR4 介導(dǎo)的炎性反應(yīng)與子癇前期有密切的關(guān)系。子癇前期孕婦的滋養(yǎng)層細(xì)胞及胎盤組織中 TLR4蛋白的表達(dá)比正常孕婦增加，它們認(rèn)為滋養(yǎng)細(xì)胞可通過 TLR4 識(shí)別母胎界面的“危險(xiǎn)信號”(細(xì)菌微生物或內(nèi)源性損傷相關(guān)分子)，使母體的細(xì)胞因子環(huán)境平衡被打破從而導(dǎo)致子癇前期的發(fā)生[6]，以上研究證明子癇前期與TLR4有關(guān)。

NF-κB與細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)，氧化酶系統(tǒng)等共同參與子癇前期的發(fā)病過程。細(xì)胞周期因子Dl(cyclinD1)啟動(dòng)子含有2個(gè)NF-κB結(jié)合位點(diǎn)，激活的NF-κB可啟動(dòng)細(xì)胞周期素cyclinDl的轉(zhuǎn)錄，由此可能導(dǎo)致滋養(yǎng)細(xì)胞異常，異常滋養(yǎng)細(xì)胞侵入子宮動(dòng)脈，使子宮螺旋動(dòng)脈內(nèi)皮損傷，最終發(fā)展為動(dòng)脈粥樣硬化，胎盤灌流量減少而缺血缺氧[7]；本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,子癇前期患者血清中HMGB1、TLR4和NF-κB P65的含量較正常組明顯升高；且重度子癇前期患者高于輕度子癇前期，提示HMGBl與Toll樣受體(TLR4)結(jié)合后激活NF-B信號通路。在炎性細(xì)胞中，Toll樣受體與其配體(HMGB1)相結(jié)合后通過募集連接蛋白MyD88，能強(qiáng)烈活化NF-κB信號通路[8]。實(shí)驗(yàn)已證實(shí)，抗HMGB1抗體能抑制巨噬細(xì)胞中 TNF、IL- 6合成[9]。抑制NF-κB核轉(zhuǎn)運(yùn)等信號途徑可起到抗炎效應(yīng),這在許多實(shí)驗(yàn)性動(dòng)物身上已得到證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)通過研究 HMGB1、TLR4、NF-κB p65 在子癇前期疾病中的表達(dá)特征及相互關(guān)系，證實(shí)三者在子癇前期疾病的發(fā)生機(jī)制中發(fā)揮了重要作用。通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果今后可研究如何抑制內(nèi)源性分子HMGB1的胞外炎性作用及開發(fā)有效穩(wěn)定的HMGB1拮抗劑，為子癇前期治療研發(fā)新靶點(diǎn)。

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新聞點(diǎn)擊

含糖加工食品與飲料恐增加心臟病風(fēng)險(xiǎn)

據(jù)美國國家科學(xué)院學(xué)報(bào)(PNAS)網(wǎng)站2013-06-18報(bào)道，2011年曾有研究指出，女性每日喝兩瓶以上含糖飲料可能會(huì)增加患心血管疾病的風(fēng)險(xiǎn)，最近又有一項(xiàng)美國德州大學(xué)健康科學(xué)中心的研究支持這個(gè)論點(diǎn)，該研究發(fā)現(xiàn)人們通過加工食品及飲料攝取過多的糖份，將使與心臟病相關(guān)的風(fēng)險(xiǎn)提高。

研究團(tuán)隊(duì)一開始先在動(dòng)物身上進(jìn)行臨床前試驗(yàn)，之后再在人類病患細(xì)胞上進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)葡萄糖代謝產(chǎn)物G6P會(huì)對心臟產(chǎn)生傷害，研究主要作者Heinrich Taegtmeyer教授指出，高血壓或其它疾病本來就會(huì)對心臟造成壓力，如果患者又?jǐn)z取過多的葡萄糖，將只會(huì)讓心臟的狀況更加嚴(yán)重。

研究解釋，當(dāng)人體攝取太多的糖與淀粉，葡萄糖代謝產(chǎn)物G6P就會(huì)逐漸形成，進(jìn)而對心臟造成壓力，而光是一分子的G6P就可以使心臟功能出現(xiàn)不正?！，F(xiàn)階段醫(yī)生只能以給予患者利尿劑控制水分，以及beta阻斷劑、ACE抑制劑以降低心臟的壓力，使其能較正常運(yùn)作，但在過去20年都一直沒有出現(xiàn)新的治療方式。

該研究刊載于美國心臟協(xié)會(huì)期刊(Journal of the American Heart Association)。

Increase of HMGB1, TLR4 and NF-κB in placenta and serum in patients with preeclampsia

WU Jian-bo, WU Xiu-yan, HU Ji-fen*

(Dept. of Obstetrics and Gynecology,the First Hospital of Fujian University,Fuzhou 350005,China)

Objective To evaluate the expression and discussion on high mobility group protein (HMGB1)/toll like receptor 4 (TLR4) and NF-κB possible role in the signaling pathway in preeclampsia. Methods Ten patients with mild preeclampsia(MP), 20 patients with severe preeclampsia(SP) and 30 cases of normal pregnancy were recruited the same period.To check the expression of the HMGB1,TLR4,NF-κB P65 protein in placenta tissue using Immunohistochemical staining.Levels of HMGB1,TLR4,NF-κB P65 in blood serum were measured by ELISA. Results 1)Expression of HMGB1,TLR4,NF-κB P65 were increased as compare to control group(P<0.05); HMGB1,TLR4,NF-κB P65 in placenta of patients with severe preeclampsia and mild preeclampsia failed to show significant difference.2)HMGB1,TLR4,NF-κB P65 in women with preeclampsia was significantly higher than control group(P<0.05); HMGB1,TLR4,NF-κB P65 in women with severe preeclampsia showed a higher level as compared to mild preeclampsia (P<0.05).Conclusions HMGB1,TLR4 and NF-κB P65 were over-expressed in the placenta tissue and serum in patients with preeclampsia, which indicated that HMGB1,TLR4 and NF-κB P65 may play an important role in the development of preeclampsia.

preeclampsia; inflammatory reaction; HMGB1; TLR4; NF-κB P65

2014- 03- 27

2014- 06- 22

福建醫(yī)科大學(xué)教授基金(JS06043); 福建省醫(yī)科大學(xué)青年骨干教師專項(xiàng)基金(JGG201310)

1001-6325(2015)01-0033-05

R714.2

A

*通信作者(corresponding author)：