胡 深，張洪義*，趙 剛，劉 壘，史 斌，李文兵，常 鵬

(1.安徽醫(yī)科大學(xué) 空軍臨床學(xué)院， 安徽 合肥 230023； 2.中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院 肝膽外科， 北京 100142；3.大連醫(yī)科大學(xué) 研究生學(xué)院， 遼寧 大連 116044)

?

研究論文

不同+Gz重復(fù)持續(xù)暴露對(duì)大鼠肝臟組織損傷及GRP78的表達(dá)影響

胡 深1，張洪義1*，趙 剛2，劉 壘3，史 斌2，李文兵2，常 鵬1

(1.安徽醫(yī)科大學(xué) 空軍臨床學(xué)院， 安徽 合肥 230023； 2.中國(guó)人民解放軍空軍總醫(yī)院 肝膽外科， 北京 100142；3.大連醫(yī)科大學(xué) 研究生學(xué)院， 遼寧 大連 116044)

目的探討不同正加速度(+Gz)暴露下大鼠肝臟損傷及葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(GRP78/Bip)在肝臟組織內(nèi)分布和表達(dá)的變化。方法將SD大鼠24只，隨機(jī)分為對(duì)照、+6Gz、+9Gz和+12Gz組，每組6只，峰值作用時(shí)間3 min，加速度增長(zhǎng)率0.5 G/s，間隔30 min，重復(fù)間斷連續(xù)5次。HE染色觀察肝組織，并測(cè)定血漿天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AST) 和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶(ALT)，用免疫組化法和Western blot測(cè)定肝臟組織中GRP78的表達(dá)。結(jié)果與對(duì)照組相比，+9Gz組、+12Gz組轉(zhuǎn)氨酶水平均顯著升高；且在ALT水平上，+12Gz組高于+9Gz組(P<0.05)；HE染色顯示正加速度組肝細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間隙不清晰，空泡樣改變，且隨G值增長(zhǎng)而加重。與對(duì)照組相比，GRP78/Bip表達(dá)分布主要集中在細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)；各實(shí)驗(yàn)組的GRP78表達(dá)均顯著升高(P<0.05)。且+12Gz組明顯高于+6Gz組和對(duì)照組(P<0.05)，肝臟組織中GRP78/Bip蛋白表達(dá)水平隨G值升高而升高；+12Gz組和+9Gz組都高于+6Gz組和對(duì)照組(P<0.05)。結(jié)論GRP78/Bip的表達(dá)可能在加速度引起的肝臟應(yīng)激反應(yīng)有著正相關(guān)的作用。

加速度；肝損傷；葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78；病理；免疫組化；蛋白質(zhì)印跡

進(jìn)入21世紀(jì)以來(lái)，隨著高性能戰(zhàn)機(jī)的裝備使用，高+Gz的過(guò)載值、重視短距起降、發(fā)展超音速遠(yuǎn)程巡航作戰(zhàn)能力和“隱身”能力成為各國(guó)空軍的發(fā)展目標(biāo)，也導(dǎo)致空勤人員所處的航空生理環(huán)境發(fā)生相應(yīng)的變化。飛行員經(jīng)常、反復(fù)地暴露于+Gz 環(huán)境中，身體各系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生應(yīng)激反應(yīng)。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于+Gz對(duì)腦、心、腎等重要器官影響的研究報(bào)道很多,現(xiàn)已證實(shí)重復(fù)持續(xù)加速度對(duì)于大鼠模型心臟和大腦的病理生理改變有影響[1- 2]，但關(guān)于+Gz對(duì)肝臟影響的研究較少。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose regulated protein78,GRP78)又稱為Bip，其定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)的中心調(diào)節(jié)劑[3]。GPR78/Bip蛋白通過(guò)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中協(xié)助多聚體蛋白質(zhì)復(fù)合物的形成，起到保護(hù)和維持細(xì)胞正常代謝作用。最近10年內(nèi)，有關(guān)GRP78/Bip的研究以氧化應(yīng)激、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激、創(chuàng)傷應(yīng)激以及藥物和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)缺乏應(yīng)激居多。本研究通過(guò)離心機(jī)實(shí)驗(yàn)?zāi)M重復(fù)持續(xù)性+Gz對(duì)大鼠肝臟影響，觀察不同高+Gz下肝臟細(xì)胞的損傷變化，探討其損傷的原理及不同+Gz條件下肝組織中GRP78/Bip 含量變化及其意義。

1 材料與方法

1.1 材料

清潔級(jí)雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量(195±10)g(由軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供，編號(hào):SCKK- 2012-COO4)；GRP78、牛血清蛋白BSA(Sigma公司)；DAB顯色(ZSGB-BIO公司)；光學(xué)顯微鏡(Olimpus BX51)；圖像分析系統(tǒng)(CMIAS，空軍總醫(yī)院)；蛋白提取混合劑(凱基公司)；BCA蛋白測(cè)定試劑盒(索萊寶公司)；TEMED、 Tris堿、甘氨酸GLYCINE(AMRESCO公司)；預(yù)染的蛋白Marker (Trermo公司)；β-actin 單克隆抗體、羊抗兔二抗(中杉公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 分組：大鼠適應(yīng)飼養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。隨機(jī)分成對(duì)照組、+6Gz組、+9Gz組和+12Gz組，每組6只。

1.2.2 造模與取材：參照文獻(xiàn)[4]等的加速度暴露方法建立模型；實(shí)驗(yàn)結(jié)束后30 min，使用10%水合氯醛麻醉(0.5 mL/100 g)，無(wú)菌操作，經(jīng)腹正中線剖腹，下腔靜脈采血，然后迅速切取肝臟標(biāo)本，每只動(dòng)物肝臟切割保存5塊大小約為1 cm×1 cm×1 cm，切割部位隨機(jī)選取，使用0.9%氯化鈉注射液沖洗肝組織上殘留血液，用10%甲醛固定；其余部分迅速液氮冷凍保存。

1.2.3 血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST:ALT和AST檢測(cè)麻醉后常規(guī)肝下下腔靜脈采血4 mL，用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)血清AST、ALT水平。

1.2.4 HE染色和光鏡觀察：取新鮮肝臟組織塊，常規(guī)修整制作HE切片。光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察組織形態(tài)學(xué)變化。

1.2.5 大鼠肝組織GRP78蛋白免疫組化：常規(guī)石蠟包埋，隨機(jī)肝臟組織切片制作，每塊標(biāo)本隨機(jī)連續(xù)切片5張，切片厚度5 μm，用ABC法進(jìn)行免疫組化，主要過(guò)程包括：H2O2甲醛封閉內(nèi)源性過(guò)氧化物酶，正常綿羊血清阻斷，胰蛋白酶消化，用PBS漂洗5 min×3次。滴加按要求稀釋的一抗GRP78 (稀釋濃度1∶100)，4 ℃冰箱孵育過(guò)夜后，經(jīng)0.01 mol/L PBS洗5 min×3次，加生物素化二抗和ABC復(fù)合物孵育。DAB顯色。37 ℃孵育30 min DAB 顯色常規(guī)脫水透明中性樹(shù)膠封片。陽(yáng)性細(xì)胞為黃色, 在光學(xué)顯微鏡下觀察整張切片的表達(dá)情況，在400倍視野下每張切片隨機(jī)選取5個(gè)陽(yáng)性染色區(qū)域，光鏡下計(jì)數(shù)陽(yáng)性細(xì)胞; 并用圖像分析系統(tǒng)測(cè)量陽(yáng)性細(xì)胞的平均吸光度、積分吸光度和平均灰度,每個(gè)標(biāo)本取5個(gè)視野的平均值做定量分析比較。陽(yáng)性細(xì)胞越多，各值越大，提示免疫反應(yīng)越強(qiáng)。

1.2.6 Western blot檢測(cè)大鼠肝組織GRP78蛋白：秤取肝臟組織塊100 mg，液氮充分研磨，移入玻璃勻漿器，加入蛋白提取混合劑1.5 mL，充分勻漿后冰浴下超聲處理。4 ℃，13 000 r/min離心10 min，取上清。用BCA蛋白測(cè)定試劑盒，以牛血清清蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行蛋白定量，檢測(cè)各樣品蛋白濃度。采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，每孔加蛋白提取液20 g，第一孔加入預(yù)染的Marker 5 μL，以顯示蛋白位置。電泳條件為恒壓70 mV，30 min，恒壓100 mV，至溴酚藍(lán)到膠邊緣。根據(jù)marker切膠轉(zhuǎn)膜，PVDF膜用冷的100%甲醇浸泡10 s，轉(zhuǎn)膜條件為恒壓80 mV，60 min。轉(zhuǎn)膜后用洗膜緩沖液清洗5 s，非磷酸化蛋白以5%脫脂奶粉TBST溶液，磷酸化蛋白以5% BSA的TBST溶液室溫封閉1 h。加入1∶1 000 一抗，4 ℃過(guò)夜，內(nèi)參采用小鼠來(lái)源抗大鼠β-actin單克隆抗體。TBST 洗膜3 次，每次5 min，加入1∶10 000稀釋的羊抗兔二抗，內(nèi)參的二抗為山羊抗小鼠，室溫作用1 h。TBST洗膜3 次，每次5 min。在PVDF膜上滴加化學(xué)發(fā)光試劑，于暗室中作用1 min后曝光X線片3 min后記錄顯像情況，采用Quantity One v4.6.2軟件進(jìn)行吸光度(A)值分析，目的蛋白的表達(dá)量以目的蛋白條帶與對(duì)應(yīng)β-actin條帶的吸光度值的比值表示。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 血清轉(zhuǎn)氨酶ALT和AST

與對(duì)照組相比，+9Gz組、+12Gz組轉(zhuǎn)氨酶水平均顯著升高，且在ALT水平上，+12Gz組高于+9Gz組(P<0.05)(表1)。

表1 實(shí)驗(yàn)各組的大鼠血清轉(zhuǎn)氨酶AST和ALT數(shù)據(jù)

groupALT(U/L)AST(U/L)control 4238±929 124±42+6Gz 4850±593 134±21+9Gz 5420±475? 166±32+12Gz 6120±896?# 213±80?

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with +6Gz group.

2.2 HE染色和光鏡觀察

肝組織HE染色后光鏡下觀察顯示，對(duì)照組大鼠肝細(xì)胞以中央靜脈為中心呈放射狀排列，細(xì)胞壁完整，形態(tài)未見(jiàn)異常；HE染色顯示實(shí)驗(yàn)組肝細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間隙不清晰，空泡樣改變，且隨G值增長(zhǎng)而加重。+6Gz組部分肝細(xì)胞索排列紊亂，輕度水腫，部分細(xì)胞壁破壞，形態(tài)不規(guī)則；+9Gz和+12Gz組部分肝細(xì)胞排列紊亂，細(xì)胞壁破壞，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間的間隙不清晰，部分出現(xiàn)空泡樣改變，明顯水腫，肝竇閉合。肝臟組織病理改變程度隨著Gz增加而加重(圖1)。

2.3 免疫組化結(jié)果分析

正常大鼠肝臟組織中也存在GRP78蛋白陽(yáng)性信號(hào)，免疫組化染色陽(yáng)性信號(hào)為棕黃色(箭頭指示)，陽(yáng)性表達(dá)的GRP78 蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中，細(xì)胞系反應(yīng)為陰性；實(shí)驗(yàn)組陽(yáng)性表達(dá)更為明顯，棕黃色信號(hào)也較為突出。同時(shí)，觀察到+9Gz和+12Gz組肝細(xì)胞排列紊亂，形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞間隙增寬，空泡樣改變，但以+12Gz組更為嚴(yán)重(圖2)。CMIAS 病理分析系統(tǒng)定量分析結(jié)果，實(shí)驗(yàn)各組的MA值均比對(duì)照組高，且隨G值得升高M(jìn)A值升高。+9Gz組高于對(duì)照組 (P<0.05)，+12Gz組高于+9Gz組(P<0.05)(表2)。

A.stress control group；B.+6Gz group；C.+9Gz group；D.+12Gz group

A.stress control group；B.+6Gz group；C.+9Gz group；D.+12Gz group； Arrow shows the protein expression, Magnification

groupAA IAMGVcontrol 024±001995±0178677±246+6Gz 027±001 1125±0619150±115+9Gz 030±002? 1296±069?9427±211?+12Gz 033±004?# 1456±130?# 10117±341?#

*P<0.05 compared with control group;#P<0.05 compared with +6Gz group.

2.4 Western blot結(jié)果分析

在曝光3 min后，+9Gz組和+12Gz組相比差異顯著，蛋白表達(dá)水平明顯增加(P<0.05)；同時(shí)，+12Gz組較+6Gz組差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。各組大鼠肝臟組織GPR78，3 min表達(dá)水平(圖3,4)。

圖3 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)曝光3 min各組大鼠肝臟GPR78蛋白的水平Fig 3 Protein expression of GPR78/Bip in liver of rats under different levels +Gz stress by Western blot after 3 min

*P<0.05 compared with control group; #P<0.05 compared with +6Gz group圖4 GRP78蛋白表達(dá)的比較Fig 4 The comparison of GRP78 protein expression

3 討論

現(xiàn)代高性能戰(zhàn)斗機(jī)在飛行中產(chǎn)生的+Gz可高達(dá)+9Gz以上，其持續(xù)時(shí)間可達(dá)15～45 S，已超出了人體正常的耐受限度。研究發(fā)現(xiàn)由于正加速度暴露導(dǎo)致血液向下端肢體和胃腸道分布、回心血量減少，因此有學(xué)者推測(cè)+Gz暴露可以導(dǎo)致肝動(dòng)脈和門(mén)靜脈向肝臟和膽道系統(tǒng)供血明顯減少，通過(guò)誘導(dǎo)肝臟內(nèi)微循環(huán)損害導(dǎo)致肝膽系統(tǒng)繼發(fā)性損傷[5]。在正加速度重復(fù)暴露下，大鼠肝臟超氧化物歧化酶SOD含量明顯降低，重復(fù)+10Gz應(yīng)激導(dǎo)致肝臟氧自由基代謝能力下降[6]。在持續(xù)性加速度暴露作用下，肝臟糖異生作用增加，從而適應(yīng)不同的G值作用[7]。

本實(shí)驗(yàn)，在不同的重復(fù)持續(xù)性正加速度(+Gz)的作用下，尤其首次使用12Gz超高值暴露，發(fā)現(xiàn)血漿ALT和AST隨G值的增加呈明顯的上升趨勢(shì)；HE染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞索結(jié)構(gòu)紊亂，細(xì)胞水腫，肝竇閉合，部分出現(xiàn)空泡樣改變，且以+12Gz組最為嚴(yán)重。以往對(duì)GRP78的研究發(fā)現(xiàn)該蛋白對(duì)細(xì)胞內(nèi)外環(huán)境的改變極為敏感。在氧化應(yīng)激、缺血損傷、鈣穩(wěn)態(tài)紊亂時(shí)ER應(yīng)激反應(yīng)標(biāo)志就是相關(guān)蛋白的表達(dá)，主要包括 ER 分子伴侶如 GRP78、GRP94 等[8]。

GRP78/Bip是一種葡萄糖調(diào)節(jié)性蛋白質(zhì),業(yè)已證實(shí)GRP78/Bip由HSPA5基因編碼，被視為一個(gè)重要的管家基因[9]。GRP78/Bip有利于新合成蛋白質(zhì)的運(yùn)輸、折疊[10]，其伴侶功能包括細(xì)胞間蛋白的傳導(dǎo)、降解不穩(wěn)定和錯(cuò)誤折疊的蛋白等。同時(shí)，在應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)時(shí)其基因的轉(zhuǎn)錄活性可提高10～25倍，維持ER鈣穩(wěn)態(tài)及內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定[11]。本研究發(fā)現(xiàn)，在加速度作用因素下，機(jī)體內(nèi)可能存在血液從新分配、動(dòng)物內(nèi)臟的相互擠壓和離心G值的綜合因素，造成血液的分配不均、離心應(yīng)激損傷，影響GRP78的表達(dá)。

通過(guò)本研究，初步證實(shí)GRP78受重復(fù)持續(xù)性+Gz的影響。在持續(xù)+Gz條件下肝臟細(xì)胞GPR78蛋白表達(dá)增強(qiáng)，且隨G值的增加而表達(dá)增強(qiáng)。+Gz對(duì)肝臟的損傷是一個(gè)復(fù)雜的病理生理過(guò)程。目前從蛋白水平對(duì)重復(fù)持續(xù)性+Gz對(duì)肝的應(yīng)激性損傷的研究仍較少。因而，關(guān)于+Gz對(duì)肝臟細(xì)胞損傷的作用機(jī)制，尤其以超高G誘導(dǎo)下，加速度應(yīng)激和氧化應(yīng)激之間的具體相關(guān)性仍待進(jìn)一步研究。

[1] Guillaume AI, Osmont D, Gaffié D,etal. Physiological implications of mechanical effects of+ Gz accelerations on brain structures[J]. Aviation, space, and environmental medicine, 2002, 73: 171- 177.

[2] Zawadzka-Bartczak EK, Kopka LH. Centrifuge braking effects on cardiac arrhythmias occurring at high+ Gz acceleration[J]. Aviation, space, and environmental medicine, 2004, 75: 458- 460.

[3] Luo S, Mao C, Lee B,etal. GRP78/BiP is required for cell proliferation and protecting the inner cell mass from apoptosis during early mouse embryonic development[J]. Molecular and cellular biology, 2006, 26: 5688- 5697.

[4] 李文兵, 孔亞林, 何曉軍, 等. 重復(fù)持續(xù)性+Gz暴露對(duì)大鼠肝組織的損傷及機(jī)制研究[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志,2014,39: 240- 244.

[5] WU ZA. Gastropic examination and clinical analysis of gastrointestinal ulcers in parachute troop [J]. Chin J Aerospace Med, 2005, 16:58- 59.

[6] Zhang QJ, Zhan H, Li T,etal. Effects of repeated+ Gz exposures on lipid peroxidation of various organs in rats[J]. Aviation, space, and environmental medicine, 2001, 14: 240- 243.

[7] Daligcon BC, Oyama J, Hannak K. Increased gluconeogenesis in rats exposed to hyper-G stress[J]. Life sciences, 1985, 37: 235- 241.

[8] Kaufman RJ. Stress signaling from the lumen of the endoplasmic reticulum: coordination of g ene transcriptional and translational controls [J]. Genes Dev, 1999, 13: 1211- 1233.

[9] Meimaridou E，Gooljar SB，Chapple JP.From hatching to dispatching：the multiple cellular roles of the Hsp70 molecular chaperone machinery [J].J Mol Endocfinol，2009,42:1- 9.

[10] Gething, M.J. Role and regulation of the ER chaperone BiP[J]. Semin Cell Dev Biol, 1999, 10: 465- 472.

[11] Yang G H, Li S, Pestka JJ. Down-regulation of the endoplasmic reticulum chaperone GRP78/Bip by vomitoxin (Deoxynivalenol)[ J]. Toxicol Appl Pharm acol, 2000, 162: 207- 217.

The damage of liver cells and the expression of GRP78 in rats liver tissue after repeated and sustained exposure to different +Gz

HU Shen1, ZHANG Hong-yi1*, ZHAO Gang2, LIU Lei3, SHI Bin2, LI Wen-bing2, CHANG Peng1

(1.Clinical Air Force School of Anhui Medical University, Hefei 230023；2.Dept. of Hepatobiliary Surgery, Air Force General Hospital, PLA,Beijing 100142; 3.Graduate School of Dalian Medical University, Dalian 116044, China)

Objective To observe the damage of liver cells and to investigate the distribution and expression of glucose-regulated protein 78 (Glucose regulated protein78, GRP78/Bip) in liver tissue under the positive acceleration (+ Gz) exposure.Methods Totally 24 wistar rats were randomly assigned to four groups: blank control,+6Gz,+9Gz and +12Gz. Each rat was clamped to the centrifuge arm, prone position, with the head of the rat facing the axis of the centrifuge for +Gz orientation. The onset rate was +0.5 Gz/s, which was used trapezoidal acceleration curve effect and controlled by computer. Blank control group rats were placed on the arm of centrifuge and underwent a process similar to that described above, but they were not exposed to acceleration. +6Gz group,+9Gz group and +12Gz group were subjected at peak time 3 min in animal centrifuge, acceleration rate 0.5 G/s, five times with

interval 30 min between times. In addition, liver tissue of rats were respectively observed by H.E. staining. Mean while, plasma aspartate aminotransferase (AST) and alanine aminotransferase (ALT) were tested determine the damage of liver function. Results +Gz acceleration stress injury increased serum AST and ALT level. Compared with the stress control, +9Gz group and +12Gz group significantly increased in plasma ALT and AST as compared with control group(P<0.05). +12Gz stress induced the highest level in these groups. The level of ALT in+2Gz group was higher than that in +6Gz group(P<0.05). HE staining showed derangement of liver cells, irregular shape, the cell gap is not clear, vacuolar changes in +Gz groups, and with the increase of G value. Compared with the control group, the expression of GRP78/Bip was focused in the cytoplasm; the expression of GRP78 in the experimental group is higher than that in the control group (P<0.05). +12Gz group was significantly higher than +6Gz group and the control group (P<0.05). The expression of GRP78/Bip in liver tissue increased with the increasing of G value levels; the expression level of GRP78/Bip in +12Gz and +9Gz groups were higher than that in +6Gz and control group (P<0.05). Conclusions There is positively related expression of GRP78/Bip, which was associated with exposure of increasing G values.

acceleration; liver injury; GRP78/Bip;pathology;immunohistochemistry; Western blot

2014- 05- 20

2014- 07- 18

全軍醫(yī)學(xué)科技“十二五”項(xiàng)目(CKJ12J022)；科技部國(guó)家科技支撐計(jì)劃(2012BAⅡ15B08)

1001-6325(2015)01-0017-05

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

*通信作者(corresponding author)：zhhyjyi1487@163.com