張汝益，何 方，王 靜，鄧 芳，李琪英，施 瓊*

(重慶醫(yī)科大學(xué) 1.檢驗醫(yī)學(xué)院 臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點實驗室； 2.麻醉系， 重慶 400016)

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研究論文

miR-30a抑制人骨肉瘤細胞143B的遷移、侵襲和活力

張汝益1，何 方1，王 靜1，鄧 芳1，李琪英2*，施 瓊1*

(重慶醫(yī)科大學(xué) 1.檢驗醫(yī)學(xué)院 臨床檢驗診斷學(xué)教育部重點實驗室； 2.麻醉系， 重慶 400016)

目的探討miR-30a對人骨肉瘤細胞143B侵襲、遷移和細胞活力的影響。方法過表達或抑制miR-30a分別處理人骨肉瘤細胞143B。劃痕實驗觀察細胞劃痕愈合能力；Transwell實驗檢測143B細胞遷移和侵襲能力；MTT實驗檢測細胞活力；定量PCR實驗確認過表達miR-30a腺病毒有效性并且檢測RUNX2 mRNA表達；Western blot檢測細胞中RUNX2總蛋白表達。結(jié)果過表達miR-30a抑制了骨肉瘤細胞143B遷移和侵襲(P<0.05)，在72 h時，miR-30a明顯抑制細胞活力(P<0.01)；抑制miR-30a的內(nèi)源性表達后，143B細胞的遷移和侵襲能力增加(P<0.05)，細胞活力也表現(xiàn)出上升水平(P<0.01)；同時過表達miR-30a可以抑制RUNX2的蛋白表達，抑制內(nèi)源性miR-30a后RUNX2蛋白水平表達增加(P<0.05)。熒光素酶活性檢測，miR-30a可以靶向于RUNX2(P<0.01)。結(jié)論miR-30a抑制骨肉瘤細胞143B的遷移、侵襲和活力，其作用可以能是通過抑制RUNX2的表達來實現(xiàn)。

miR-30a；人骨肉瘤細胞；RUNX2

骨肉瘤(osteosarcoma，OS)是起源于間葉組織的惡性腫瘤[1]。自上世紀80年代采用聯(lián)合治療策略以來，骨肉瘤患者的5年生存率大幅提高，不過近十年來雖然有不同的治療藥物問世，患者5年生存率相比前十年卻沒有明顯變化[2- 3]。如何改善病人的生活質(zhì)量并且提高5年生存率成為科學(xué)家致力研究的問題[4]。

MicroRNA是一類長度在19～25 bp的短鏈非編碼RNA,其作用主要是對轉(zhuǎn)錄后的RNA進行表觀遺傳水平的調(diào)控[5]。MicroRNA可以調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、分化，并且可以抑制或促進腫瘤的遠處轉(zhuǎn)移[6]。正是因為MicroRNA具有這些特性，使它成為潛在治療腫瘤的基因藥物[7]。本研究通過使用過表達miR-30a的腺病毒和特殊的Inhibitior抑制miR-30a，從正反兩方面探討miR-30a對人骨肉瘤細胞143B的遷移、侵襲性和活力，并對其機制作初步探索，以期為臨床提供一些依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 細胞系和病毒:人骨肉瘤細胞系143B和人胚腎細胞系HEK- 293(ATCC)。重組腺病毒Ad-RFP和Ad-miR-30a(本實驗室構(gòu)建保存)。

1.1.2 主要試劑：DMEM高糖培養(yǎng)基和胎牛血清(Hylcone公司)；PCR反轉(zhuǎn)錄試劑、定量PCR試劑和內(nèi)切酶和T4連接酶(TakaRa公司)；PCR引物和Trziol(Invitrogen公司)；Transwell小室和Western blot ECL顯影劑(Millipore公司)；抗RUNX2抗體和β-actin抗體(Santa Cruz公司)。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)：HEK-293和143B細胞均培養(yǎng)于含有10%胎牛血清和100 U/mL 青霉素、100 μg/mL鏈霉素的DMEM高糖培養(yǎng)基。置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.2 實驗分組及處理: 實驗組分為空白組(blank)、對照組(Ad-RFP)、過表達miR-30a(Ad-miR-30a)組；miR-30a抑制組(轉(zhuǎn)染mrR-30a inhibitor，In-miR-30a)，抑制劑對照組(轉(zhuǎn)染無義inhibitor，In-control)組。Ad-RFP和Ad-miR-30a感染效率在30%左右為宜。

1.2.3 劃痕實驗：將總數(shù)為1.5×105個/孔的143B細胞懸液接種于6孔板，待細胞匯合度達90%時，使用200 μL Tip頭橫豎各劃4條痕。測量多個劃痕點寬度，計算各組劃痕愈合率[(0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%]，重復(fù)3次取平均值，比較各組細胞遷移能力。

1.2.4 Transwell實驗：取對數(shù)生長期143B細胞制成懸液，將400 μL的7.5×104個/mL細胞懸液加入到鋪有基質(zhì)膠或沒有鋪基質(zhì)膠的上室，24孔板下室加入含20%胎牛血清的培養(yǎng)基600 μL。24 h后染色置顯微鏡下計數(shù)并照相。

1.2.5 MTT實驗：取對數(shù)增殖期細胞懸液，以3 000個/孔細胞數(shù)加入到96孔板，12 h后換低血清培養(yǎng)基，并加處理因素，此時計時為0 h，此后在24、48和72 h時間點再次檢測。到時間點后，各孔加入MTT試劑20 μL，繼續(xù)培養(yǎng)4 h，小心吸走培養(yǎng)基，加入150 μL/孔DMSO,置搖床避光慢搖10 min，酶標儀檢測吸光度。

1.2.6 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)實驗：各組細胞使用Trizol提取RNA，然后反轉(zhuǎn)錄成cDNA。反應(yīng)體系如下：cDNA 2 μL，SYBR? Premix Ex Taq Ⅱ 10 μL，上下游引物各0.4 μL，ddH2O 6.4 μL，Total 20 μL。

1.2.7 Western blot： 細胞裂解，離心取上清，BCA方法檢測蛋白濃度，加入緩沖液煮沸5 min置-20 ℃冰箱備用。經(jīng)10% SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉。加入一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃冰箱過夜。第2天預(yù)冷TBST洗膜3次，每次10 min，加入二抗(1∶5 000稀釋)，37 ℃反應(yīng)1 h，再次用預(yù)冷TBST洗膜3次，每次10 min。使用ECL顯影成像。

1.2.8 雙熒光素酶報告基因檢測：軟件預(yù)測到的各個靶基因位點加上Hind Ⅲ和Spe I酶切位點后用T4連接酶連接到報告載體上。使用Lipofectamine 2000將陽性質(zhì)粒和對照質(zhì)粒導(dǎo)入到293細胞中，36 h后檢測熒光素活性。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 病毒感染效率和抑制劑轉(zhuǎn)染效率

加入miR-30a和Ad-RFP病毒到143B細胞36 h后,相對Ad-GFP組，miR-30a表達顯著增加(圖1A,B)。轉(zhuǎn)染經(jīng)過熒光標簽修飾過的miR-30a的抑制劑24 h熒光顯微鏡下的圖像,轉(zhuǎn)染效率幾乎達到100%(圖1D)。

2.2 劃痕實驗檢測miR-30a對143B細胞遷移的影響

Ad-miR-30a組劃痕愈合率為(53.40%±3.05%)顯著低于Ad-RFP組的(76.55%±1.16%)和空白組的(80.45%±2.78%) (P<0.05)。而加入抑制劑抑制miR-30a后，143B細胞24 h的劃痕愈合率(100%)明顯比加入無義inhibitor的細胞或者沒有加處理因素的143B細胞的劃痕愈合率升高(圖2)。

2.3 Transwell檢測miR-30a對143B細胞遷移、侵襲的影響

感染腺病毒Ad-miR-30a后,穿過小室膜的細胞明顯比Ad-GFP和空白組少(P<0.05)，但是In-miR-30a組穿出的細胞比In-control組和空白組明顯增多(P<0.05)。鋪基質(zhì)膠，模擬體內(nèi)腫瘤細胞侵襲過程，加入Ad-miR-30a，143B細胞穿膜數(shù)顯著下降，而使用i抑制劑抑制miR-30a后，143B細胞穿膜數(shù)顯著上升 (P<0.05)(圖3)。

2.4 MTT檢測miR-30a對143B細胞活力的影響

在24，48和72 h分別檢測了143B細胞的活力，過表達miR-30a在72 h過可以明顯降低143B活力，而抑制miR-30a后143B細胞活力相對空白組升高(P<0.01)(圖4)。

2.5 尋找miR-30a的靶向基因

通過預(yù)測軟件對miR-30a的靶基因進行預(yù)測，找到RUNX2這個靶基因。qRT-PCR并且對產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳，RUNX2 mRNA表達在幾組細胞里無明顯變化(圖5A)。過表達miR-30a后RUNX2蛋白表達下降，抑制內(nèi)源性miR-30a后RUNX2蛋白表達增加。

A. 143B cells infected with Ad-miR-30a; B.143B cells infected with Ad-RFP; C.investigated adenovirus miR-30a expression mature miR-30a; D.143B cells were transfected with miR-30a inhibitor;*P<0.05 compared with blank

圖1 驗證過表達miR-30a的腺病毒和抑制miR-30a的抑制劑的有效性

Fig 1 To identify the effectiveness of Aα-miR-30a and its in hibitor(×40)

圖2 劃痕實驗檢測miR-30a對143B細胞遷移的影響

*P<0.05 compared with control group

*P< 0.01 versus control cells圖4 MTT檢測miR-30a對143B細胞活力的影響Fig 4 The effects of miR-30a on 143B cell viability

A.PCR; B.Western blot圖5 miR-30a對Runx2 mRNA和蛋白水平的影響Fig 5 Effect of miR-30a on RUNX2 mRNA and protein levels

2.6 miR-30a靶向RUNX2 3′-UTR

miR-30a顯著抑制RUNX2 3′-UTR第3個靶位點熒光酶活性(P<0.01)(圖6)。

3 討論

自1993年第一個MicroRNA鑒定完成以來[8]，截止作者發(fā)稿時已經(jīng)有24,521個MicroRNAs被列入數(shù)據(jù)庫miRBase。如此多的MicroRNAs被人們發(fā)現(xiàn)足見其重要性。

本研究對象miR-30a不僅可以調(diào)節(jié)成骨分化，在乳腺癌、胃癌和子宮內(nèi)膜癌等癌癥中也有異常的表達水平。骨肉瘤的主要發(fā)生機制就是骨組織成骨、破骨功能紊亂，青春期人體開始二次發(fā)育，骨骼也隨之快速增長，特別是股骨遠端和脛骨近端的生長更是決定一個人的身高水平， 而骨肉瘤的好發(fā)部位也正是在這兩個地方[9]。本研究利用腺病毒過表達miR-30a后骨肉瘤細胞143B的遷移和侵襲明顯受到抑制，而用特異性抑制劑抑制miR-30a后143B細胞的遷移和侵襲能力大大提高，提示骨肉瘤細胞143B的遷移和侵襲受到miR-30a的調(diào)控。為了闡明miR-30a調(diào)控143B細胞的具體機制，利用靶基因預(yù)測軟件對miR-30a的靶基因進行了預(yù)測，找到了RUNX2這個潛在靶基因。相關(guān)研究表明，RUXN2可以調(diào)控TLN1和PTK2而控制骨肉瘤細胞的運動活力[10]。也有研究發(fā)現(xiàn)RUNX2的表達和骨肉瘤的轉(zhuǎn)移有很大的相關(guān)性[11]。本實驗也發(fā)現(xiàn)過表達miR-30a后RUNX2的蛋白水平下降，說明RUNX2是miR-30a的一個靶基因，這與前人的報道一致[12]。綜上，通過本研究說明miR-30a抑制骨肉瘤細胞的遷移和侵襲并且可能是通過靶向RUNX2來實現(xiàn)。

*P< 0.01 compared with no-miR group圖6 熒光素酶報告基因?qū)嶒灆z測miR-30a是否靶向于RUNX2基因3′-UTRFig 6 Luciferase activity in 293 cells

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miR-30a suppresses migration, invasion and vitality of human osteosarcoma cell line 143B

ZHANG Ru-yi1, HE Fang1, WANG Jing1, DENG Fang1, LI Qi-ying2*, SHI Qiong1*

(1.Key Laboratory of Clinical Laboratory Diagnostics,Ministry of Education,College of Laboratory Medicine; 2.Dept. of Anesthesiology, Chongqing Medical University,Chongqing 400016,China)

Objective To investigate the effect of miR-30a on human osteosarcoma cell 143B in migration,invasion and cell viability. Methods 143B cells were infected or transfected with recombinant adenovirus miR-30a (Ad-miR30a) and miR-30a inhibitor respectively. Wound healing assay was performed to detect the cell healing ability(P<0.05). Cell migration and invasion ability were determined by Transwell assay(P<0.05).The cell viability was analyzed by MTT assay(P<0.01). Real-time quantitative PCR was performed to analyze the expression ofRUNX2 mRNA level and confirmed the adenovirus miR-30a expressed in 143B cells.The expression of RUNX2 was analyzed by Western blot. miR-30a target toRUNX2 was verified by luciferase reported gene assay. Results The ability of migration and invasion was suppressed in osteosarcoma cell 143B by overexpression miR-30a,and the cell viability also decreased.After the endogenous miR-30a being inhibited, the cell motility and invasion enhanced and the cell viability was promoted.The RUNX2 protein decreased after overexpression miR-30a as compared with control group. The luciferase activity ofRUNX2 decreased by adding miR-30a.Conclusions 143B cell migration,

invasion and viability were suppressed by miR-30a,and this process is potentially achieved via suppressing RUNX2 protein expression.

miR-30a; human osteosarcoma cell line; RUNX2

2014- 06- 09

2014- 10- 08

國家自然科學(xué)基金(31200971)

1001-6325(2015)01-0012-05

R738.1

A

*通信作者(corresponding author)：anniesq8718@aliyun.com; alny68@163.com