張巖巖，胡亞萍，張雪梅，劉 歡，王 鵬，王欽富

（大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

豬肺臟巨噬細(xì)胞的分離培養(yǎng)

張巖巖，胡亞萍，張雪梅，劉 歡，王 鵬，王欽富*

（大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

提取分離豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）、豬肺血管巨噬細(xì)胞（PIM）、豬肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞（IM）三種細(xì)胞并進(jìn)行體外培養(yǎng)，采用免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)進(jìn)行細(xì)胞的異質(zhì)性研究。無(wú)菌條件下通過(guò)支氣管肺泡灌洗獲取PAM，右心室插管經(jīng)心臟行肺血管原位灌注的方法分離得到PIM，肺組織機(jī)械處理結(jié)合酶消化法(膠原酶IA)分離IM。顯微鏡下觀(guān)察三種細(xì)胞的形態(tài)上的不同；免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型。三種巨噬細(xì)胞形態(tài)有明顯的不同，PAM較大，表面粗糙，PIM和IM較小，并且細(xì)胞光滑；PAM細(xì)胞大多為CD163陽(yáng)性，IM和PIM則CD86陽(yáng)性較多。PAM、PIM、IM在形態(tài)和表型上存在異質(zhì)性。

豬肺泡巨噬細(xì)胞；豬肺血管巨噬細(xì)胞；豬肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞

巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的免疫細(xì)胞之一，它可以識(shí)別并對(duì)侵入組織和血液中的病原體做出迅速反應(yīng)，進(jìn)一步激發(fā)炎癥反應(yīng)，激活體內(nèi)免疫反應(yīng)，最后清除病原體并維護(hù)內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)[1]。炎癥是機(jī)體對(duì)體內(nèi)外損傷性因素產(chǎn)生的病理生理性反應(yīng)，適度的炎癥反應(yīng)對(duì)機(jī)體是有利的，有助于清除感染、異物、老化細(xì)胞等，但是過(guò)度或持續(xù)的炎癥反應(yīng)則會(huì)造成不同程度的組織損傷。有研究表明炎癥與肥胖、腫瘤、感染（慢性感染）、糖尿病、代謝綜合征、關(guān)節(jié)炎、動(dòng)脈粥樣硬化等多種疾病病理過(guò)程的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[2-4]。甚至認(rèn)為腫瘤、糖尿病、關(guān)節(jié)炎等難以攻克的重大疾病本身就是一種難以治愈的―炎癥”[5]。近來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞在代謝性疾病中既可以發(fā)揮促炎作用，同時(shí)還能抑制炎癥的發(fā)生[6-7]。

肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）是機(jī)體抵御外來(lái)微生物侵襲肺臟的第一道防線(xiàn)，不僅具有吞噬和抗原提呈功能，還能分泌多種生長(zhǎng)因子、前列腺素、白介素、補(bǔ)體、腫瘤壞死因子等調(diào)節(jié)和啟動(dòng)免疫炎性反應(yīng)。肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞（IM）常被看作是一個(gè)細(xì)胞發(fā)育期間的中間物[8]。肺血管巨噬細(xì)胞（PIM）是肺巨噬細(xì)胞亞群之一，位于肺泡壁毛細(xì)血管腔內(nèi)，緊貼于毛細(xì)血管內(nèi)細(xì)胞表面，吞噬、分泌功能非常活躍，是肺防御的主要成員。三種巨噬細(xì)胞是肺內(nèi)最主要的三種巨噬細(xì)胞亞群，正常情況下兩者存在明顯的異質(zhì)性，表現(xiàn)在形態(tài)、結(jié)構(gòu)、功能及表型等方面[9]。隨著對(duì)各大疾病的深入研究，幾乎所有疾病的發(fā)生發(fā)展都與免疫息息相關(guān)，巨噬細(xì)胞原始起源于骨髓而后最終填充到身體的其他領(lǐng)域發(fā)揮作用。實(shí)驗(yàn)主要在建立了豬的這三種細(xì)胞分離純化方法的基礎(chǔ)上，研究它們?cè)谛螒B(tài)及功能上的差異。為進(jìn)一步研究肺內(nèi)巨噬細(xì)胞亞群間的異質(zhì)性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

仔豬購(gòu)自大連金州某規(guī)模養(yǎng)殖場(chǎng)15天左右的健康小乳豬。處死之前讓其自由的進(jìn)食及飲水，靜脈放血至死。

1.1.2 主要試劑

氨芐青霉素6 mg（1mg約1670單位）、硫酸鏈霉素13 mg（1mg約798單位）、1640細(xì)胞培養(yǎng)液、胎牛血清、硝酸鈉、Hanks液、PBS、檸檬酸緩沖液，均購(gòu)自上海生物工程有限公司；96孔細(xì)胞板購(gòu)自Costar公司；膠原酶IA購(gòu)自sigma。Anti-CD163/PE Conjugated、Anti-CD86/pE Conjugated，購(gòu)自上海益欣生物科技有限公司；磷酸二氫鉀、無(wú)水乙醇、檸檬酸三鈉，購(gòu)自天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司；磷酸氫二鈉，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；二甲苯，購(gòu)自遼寧新興試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 肺組織石蠟切片免疫組化技術(shù)

取正常豬肺組織切成0.5 cm×0.5 cm×0.2 cm大小，將組織分別放入75%、85%、90%、95%、100%梯度脫水各1 h；然后放入二甲苯Ⅰ、二甲苯Ⅱ各1h進(jìn)行透明；再分別放入54℃石蠟浸蠟1 h，室溫冷卻、切片。在60度的烤箱中烘烤切片5 min，石蠟切片脫蠟后用PBS洗2次每次5 min?？乖迯?fù)：微波爐30min，浸泡在裝滿(mǎn)檸檬酸鹽緩沖液的染色盒中；冷卻到室溫再用PBS洗3次每次5 min。5%正常牛血清（PBS稀釋?zhuān)┓忾]，室溫孵育20 min，傾去血清，勿洗。滴加稀釋一抗工作液，4℃過(guò)夜。PBS沖洗3次，每次5 min。滴加適量熒光標(biāo)記二抗工作液，室溫孵育1 h后PBS沖洗3次。熒光顯微鏡觀(guān)察拍照。

1.2.2 PAM的分離培養(yǎng)

取仔豬肺臟，用漏斗將約200 mL無(wú)菌、4℃預(yù)冷的 PBS從氣管灌入肺臟內(nèi)；輕輕按摩肺葉后倒出支氣管肺泡灌洗液；重復(fù)上述沖洗過(guò)程3～4次，將每次得到的灌洗液混合在一起，100目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾；低溫冷凍離心機(jī)（4℃）離心10 min，轉(zhuǎn)速為1500 r/min，收集細(xì)胞，用無(wú)血清的培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞2次；加入 RPMI-1640（10%胎牛牛血清），于 37℃ 5%CO2、飽和濕度條件下貼壁2 h，棄去未貼壁的細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞即為PAM。

1.2.3 PIM的分離培養(yǎng)

從右心室插管經(jīng)心臟行肺血管原位灌注，依次用0.75%硝酸鈉溶液250 mL消化血管壁上的血細(xì)胞；無(wú)鈣、鎂Hanks液配制的0.04% EDTA Na21000 mL清洗肺血管腔；5ml 2.75% CaCl2溶液加入 250 mL 0.025%膠原酶溶液，以此新鮮配制的膠原酶液灌注，以使 PIM 與肺血管內(nèi)皮細(xì)胞分離，并于此時(shí)開(kāi)始自左心室插管收集灌注液；最后用無(wú)鈣、鎂Hanks液灌注，收集灌洗液1500 r/min離心10 min，Hanks液清洗，含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基重懸細(xì)胞，于37℃ 5%CO2、飽和濕度條件下貼壁2 h，洗棄未貼壁的細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞即為PIM。

1.2.4 IM的分離培養(yǎng)

將灌洗后的肺組織剪碎至 1 mm3以下，加入0.025%膠原酶IA，在37℃恒溫培養(yǎng)箱中消化60 min，200目不銹鋼篩網(wǎng)過(guò)濾，收集到的組織消化液 1500 r/min離心10 min，10%胎牛血清的RPMI-1640重懸細(xì)胞，于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下貼壁2 h，洗去未貼壁細(xì)胞，貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞即為IM。

1.2.5 細(xì)胞形態(tài)的觀(guān)察

12孔板接種細(xì)胞，PAM、PIM、IM的細(xì)胞密度為2×106個(gè)/mL。光學(xué)顯微鏡40倍鏡下觀(guān)察PAM、PIM、IM形態(tài)。

1.2.6 流式細(xì)胞術(shù)鑒定PAM、PIM、IM細(xì)胞膜蛋白CD86、CD163的表達(dá)

棄掉12孔板上層細(xì)胞培養(yǎng)液，PBS洗一遍，加1 mL2 mMEDTA消化細(xì)胞2 min；加2 mL培養(yǎng)液終止消化；查細(xì)胞數(shù)，稀釋?zhuān)魇郊?xì)胞術(shù)檢測(cè)時(shí)每管500 uL，細(xì)胞數(shù)不少于 1萬(wàn)個(gè)；流式管離心后剩余100 uL液體，按1∶100加入1 ul抗體室溫孵育2 h后，PBS加入500 uL，1500 r/min離心5 min去上清；加入PBS500 uL，上流式細(xì)胞儀測(cè)細(xì)胞膜蛋白的表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1 肺組織石蠟切片免疫組化結(jié)果

豬肺臟組織做石蠟切片結(jié)果如圖1。豬肺組織中PAM大多表現(xiàn)為CD163陽(yáng)性，而CD86陽(yáng)性極少；IM中CD163陽(yáng)性很少，CD86陽(yáng)性較多。肺組織石蠟切片免疫組化結(jié)果如圖1。

圖1 肺臟免疫組化結(jié)果

2.2 光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)的觀(guān)察

經(jīng)肺泡灌洗，能得到大量的PAM，PAM細(xì)胞大、形態(tài)不太均一、表面粗糙；心臟行肺血管原位灌注的方法能得到純化的PIM，機(jī)械方法處理肺組織，經(jīng)酶消化可獲取大量IM細(xì)胞，IM和PIM細(xì)胞形態(tài)均一、直徑較小，并且細(xì)胞光滑。光學(xué)顯微鏡觀(guān)察三種細(xì)胞形態(tài)，如圖2。

圖2 PAM、PIM、IM三種細(xì)胞形態(tài)（40×）

2.3 流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞膜蛋白CD86、CD163的表達(dá)結(jié)果

PAM、IM、PIM細(xì)胞表面CD163、CD86的表達(dá)量有較大的差異，結(jié)果如圖3。根據(jù)圖3可得如表1的統(tǒng)計(jì)結(jié)果，PAM細(xì)胞的CD163陽(yáng)性率明顯高于CD86，而PIM和IM的CD86陽(yáng)性率高于CD163，并且PAM細(xì)胞的CD163陽(yáng)性率高于PIM和IM的陽(yáng)

性率，但CD86恰好相反。

圖3 PAM、PIM、IM流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD86、CD163結(jié)果

表1 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)學(xué)處理結(jié)果

3 討論

豬肺巨噬細(xì)胞在豬的免疫反應(yīng)中具有重要的角色，已知豬肺內(nèi)含有不同形態(tài)、表型和功能的巨噬細(xì)胞亞群，包括肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）、肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞（IM）和肺血管內(nèi)巨噬細(xì)胞（PIM）[10]。PAM 對(duì)病原微生物的入侵性起著極其重要的作用，在抗感染免疫防御反應(yīng)，吞噬和殺菌性能是其最基本的功能[11]。PIM 位于肺泡壁接近毛細(xì)管內(nèi)細(xì)胞表面的毛細(xì)血管管腔，是肺巨噬細(xì)胞的重要亞群之一，是肺防御外界干擾的第一道防線(xiàn)，其吞噬、分泌功能非常的活躍。由于其所處的特殊部位，因此在肺部的急性炎癥性疾病如急性肺損傷中的作用尤為引人注目。肺間質(zhì)巨噬細(xì)胞（IM）是重要的免疫功能調(diào)節(jié)細(xì)胞[12]?？赏淌煽乖赏ㄟ^(guò)細(xì)胞接觸機(jī)制來(lái)影響DC始發(fā)的T細(xì)胞增殖，在IM小數(shù)量時(shí)IM可增強(qiáng)DC的功能，部分原因是其釋放抗原膚，再由DC提呈給T細(xì)胞，但當(dāng)IM數(shù)量超過(guò)50%時(shí)則抑制DC的功能，可能是由于釋放了某種可溶性抑制因子的緣故[12]。

近年來(lái)，人們對(duì)巨噬細(xì)胞異質(zhì)性的研究進(jìn)展不斷深入，已經(jīng)不像以前的研究?jī)H僅從細(xì)胞的形態(tài)、大小、表型和功能去區(qū)分不同類(lèi)型的巨噬細(xì)胞，而是更多的關(guān)注巨噬細(xì)胞一些表面抗原、關(guān)鍵酶代謝、細(xì)胞因子的表達(dá)量等分子機(jī)制的研究。人們重視巨噬細(xì)胞異質(zhì)性的研究，是為了更好的研究病變情況下的巨噬細(xì)胞變化，實(shí)驗(yàn)著重于研究巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性是為解決對(duì)大型養(yǎng)殖場(chǎng)以及人類(lèi)飲食安全帶來(lái)嚴(yán)重威脅的藍(lán)耳病機(jī)理進(jìn)行研究、預(yù)防和治療。藍(lán)耳病是由豬繁殖與呼吸系統(tǒng)綜合癥病毒（PRRSV）感染豬肺之后引起的豬肺部嚴(yán)重病變。PRRSV進(jìn)入細(xì)胞之后利用巨噬細(xì)胞里的物質(zhì)快速的進(jìn)行復(fù)制和繁殖，在豬肺部形成局部感染后再擴(kuò)散到全身組織[13]。豬繁殖與呼吸綜合征不僅對(duì)大規(guī)模的養(yǎng)殖場(chǎng)造成十分嚴(yán)重的威脅，同時(shí)也給人類(lèi)的飲食安全帶來(lái)了很大的隱患，故研究豬肺巨噬細(xì)胞的異質(zhì)性對(duì)豬藍(lán)耳病的研究具有重要的意義。

目前多數(shù)巨噬細(xì)胞的獲得都是采用灌洗法從大鼠、家兔肺內(nèi)提取[14]。我們用灌洗法獲取豬肺泡巨噬細(xì)胞（PAM）的方法取得較好的效果；右心室插管經(jīng)心臟行肺血管原位灌注的方法分離得到PIM 的方法現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道較少，獲取細(xì)胞的效果較好，可以獲得較單一的肺血管巨噬細(xì)胞，為后續(xù)試驗(yàn)做好基礎(chǔ)工作；肺組織機(jī)械處理結(jié)合酶消化法提取IM細(xì)胞，效果很好，細(xì)胞獲得數(shù)最多，但是要把握好酶作用的時(shí)間以免對(duì)細(xì)胞有害。

由體外培養(yǎng)觀(guān)察豬肺臟巨噬細(xì)胞按照其部位可以分為PAM、PIM、IM多種亞群，光鏡下PAM直徑較大，大小不一，形態(tài)呈圓形、橢圓形或不規(guī)則形，表面粗糙，如圖2（a）；PIM體積明顯小于PAM，大小均一，形態(tài)多為圓形或者橢圓形，并且細(xì)胞光滑，如圖2（b）；IM體積明顯小于PAM，大小不一，形態(tài)多為圓形或者橢圓形，如圖2（c）。目前有大量報(bào)道表明CD68為巨噬細(xì)胞共有的表面抗原，其在M1和M2中的表達(dá)量無(wú)差異。CD163在M2型細(xì)胞中的表達(dá)量明顯比M1型的細(xì)胞要高，與M2型巨噬細(xì)胞相比M1型巨噬細(xì)胞中CD86的表達(dá)量要明顯高[13]。免疫組化和流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)表明 PAM 細(xì)胞大多為CD163陽(yáng)性，IM和PIM則CD86陽(yáng)性較多。在巨噬細(xì)胞異質(zhì)性的研究中，巨噬細(xì)胞表面膜蛋白表達(dá)量的差異，在鑒定不用類(lèi)型巨噬細(xì)胞的重要依據(jù)。實(shí)驗(yàn)在建立了這三種細(xì)胞分離純化方法的基礎(chǔ)上，觀(guān)察它們?cè)谛螒B(tài)及表型上的差異。為進(jìn)一步研究肺內(nèi)巨噬細(xì)胞亞群間的異質(zhì)性提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，PRRSV與巨噬細(xì)胞之間的相互作用對(duì)于分析PRRSV感染引起的免疫抑制和持續(xù)性感染的機(jī)制有十分重要的理論意義，并對(duì)其進(jìn)形態(tài)學(xué)及其培養(yǎng)特性進(jìn)行了初步研究，為進(jìn)一步對(duì)其生物學(xué)功能研究奠定基礎(chǔ)。

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The Porcine Lung Macrophages Isolation and Culture in Vitro

ZHANG Yan-yan, HU Ya-ping, ZHANG Xue-mei, LIU Huan, WANG Peng, WANG Qin-fu*
（College of Life Science and Technology, Dalian University, Dalian 116622, China）

Extracting and separating porcine alveolar macrophages (PAM), pulmonary intravascular macrophages(PIM), interstitial macrophages (IM), three types of cells in vitro, using immunohistochemical technique and flow cytometry. Aseptic conditions by bronchoalveolar lavage for PAM, right ventricular intubation via in situ perfusion line cardiac pulmonary vascular PIM, were isolated from lung tissue mechanical treatment combined with enzyme digestion method (collagenase IA) separation of IM. Immunohistochemistry and flow cytometry to detect cell phenotype and microscope different in three kinds of cell morphology. There is obvious difference in morphology between PAM, PIM and IM. PAM is bigger and rough surface, but PIM, IM are smaller and smooth surface. PAM are mostly CD163 positive cells, IM and PIM are mostly CD86 positive PAM, PIM and IM are heterogenous in morphology and phenotype.

PAM; IM; PIM

R392.12

A

1008-2395(2015)06-0066-04

2015-09-06

張巖巖（1988-），女，碩士研究生，研究方向：分子免疫學(xué)。

王欽富（1963-），男，教授，研究方向：獸醫(yī)免疫學(xué)，分子免疫學(xué)。