王曉輝，曹洪玉，張慶芳，遲乃玉

（大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

低溫幾丁質(zhì)酶chiA基因克隆、同源建模及序列分析

王曉輝，曹洪玉，張慶芳，遲乃玉

（大連大學(xué) 生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，遼寧 大連 116622）

從假交替單胞菌（Pseudoalteromonas sp. DL-6）中克隆低溫幾丁質(zhì)酶chiA基因（GenBank登錄號(hào)KF234015）。該序列全長(zhǎng)3160個(gè)核苷酸，編碼1053個(gè)氨基酸，預(yù)測(cè)相對(duì)分子質(zhì)量113.5 KDa，等電點(diǎn)（pI）4.49，命名為chiA。功能結(jié)構(gòu)域分析顯示其編碼區(qū)包含信號(hào)肽、2個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域、2個(gè)成人多囊腎病結(jié)構(gòu)域、18家族幾丁質(zhì)酶催化域與18家族糖苷水解酶C端部分序列。利用Discovery Studio平臺(tái)以同源建模的方法構(gòu)建低溫幾丁質(zhì)酶chiA的催化域三維結(jié)構(gòu)模型，并對(duì)其進(jìn)行結(jié)構(gòu)優(yōu)化和評(píng)估，Ramachandram圖譜檢測(cè)和Verify-3D評(píng)估顯示模擬出的模型結(jié)構(gòu)合理，整體的相容性較為可信。本結(jié)果擬為后期低溫幾丁質(zhì)酶chiA的催化機(jī)理研究提供理論依據(jù)。

低溫幾丁質(zhì)酶chiA；假交替單胞菌；同源模建；序列分析

幾丁質(zhì)是海洋環(huán)境含量最豐富的可再生資源，據(jù)估測(cè)，海洋環(huán)境每年超過(guò)1011噸幾丁質(zhì)形成，其降解主要是通過(guò)產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的微生物完成[1]。酶法降解主要通過(guò)內(nèi)切酶隨機(jī)切割多糖鏈，外切酶沿糖鏈末端降解，整個(gè)水解過(guò)程是通過(guò)糖苷水解酶系來(lái)完成的[2]。酶法高效降解具有反應(yīng)條件溫和，無(wú)污染，降解過(guò)程易控制等優(yōu)點(diǎn)，是國(guó)內(nèi)外利用可再生資源的發(fā)展方向[3]。幾丁質(zhì)酶(chitinase, chi, EC3.2.1.14)降解幾丁質(zhì)生產(chǎn)的幾丁寡糖、幾丁單糖及其衍生物由于具有良好的組織兼容性和生物降解性以及調(diào)節(jié)免疫力和抗癌的保健功能等特點(diǎn)，在醫(yī)藥、食品、農(nóng)業(yè)、工業(yè)等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景[4,5]。

近年來(lái)，隨著基因工程技術(shù)的不斷發(fā)展，低溫幾丁質(zhì)酶的研究重點(diǎn)逐步轉(zhuǎn)向酶基因的克隆表達(dá)及功能研究。截至目前，僅有10多種低溫幾丁質(zhì)酶基因被克隆、測(cè)序及性質(zhì)表征，僅解析1種低溫幾丁質(zhì)酶的結(jié)晶結(jié)構(gòu)，以及1種低溫幾丁質(zhì)酶的催化域[6]，分別為來(lái)源于菌株Moritella marina的MmChi60和南極菌Arthrobacter sp. TAD20幾丁質(zhì)酶chiB的催化域。低溫幾丁質(zhì)酶的結(jié)構(gòu)解析對(duì)于深入探討低溫酶的反應(yīng)機(jī)制、底物結(jié)合和催化效率等有重要意義。蛋白結(jié)構(gòu)測(cè)定主要是依靠NMR技術(shù)和X射線(xiàn)晶體衍射，但方法復(fù)雜、價(jià)格昂貴，無(wú)法大規(guī)模測(cè)定蛋白質(zhì)信息，故以計(jì)算機(jī)技術(shù)為基礎(chǔ)的同源建模在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的研究中發(fā)揮重要作用。同源建模[7]是從蛋白的氨基酸序列出發(fā)，即在序列一致性大于30%的前提下，可以利用一個(gè)或多個(gè)相似蛋白的結(jié)構(gòu)信息來(lái)模擬建立未知結(jié)構(gòu)蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)。因此，相似蛋白之間一級(jí)序列的一致性越高，模建出來(lái)的三維結(jié)構(gòu)的準(zhǔn)確性越高。利用同源建模技術(shù)模擬蛋白質(zhì)的三維結(jié)構(gòu)，深入探討結(jié)構(gòu)信息進(jìn)而可深入了解蛋白質(zhì)的功能。

假交替單胞菌(Pseudoalteromonas)是海洋環(huán)境產(chǎn)幾丁質(zhì)酶系的代表性微生物，Tsujibo等[8-10]報(bào)道該屬分泌幾丁質(zhì)降解系統(tǒng)至少包括 4種幾丁質(zhì)酶，3種N-乙酰氨基葡萄糖苷酶，1種糖基轉(zhuǎn)移酶，1種幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白和1種蛋白酶，協(xié)同降解幾丁質(zhì)，應(yīng)用潛力巨大。但國(guó)外已報(bào)道的野生菌生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶活力較低，國(guó)內(nèi)未見(jiàn)該菌屬生產(chǎn)幾丁質(zhì)酶功能研究的相關(guān)報(bào)道。本文從海洋底泥樣品中篩選到高產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的交替假單胞菌，命名為 Pseudoalteromonas sp. DL-6(Genebank登錄號(hào)KF208362)，從該菌株克隆了低溫chiA基因，對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并使用同源建模技術(shù)模擬該蛋白催化域的三維結(jié)構(gòu)，為進(jìn)一步催化機(jī)理的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 菌株與質(zhì)粒

假交替單胞菌(Pseudoalteromonas sp. DL-6)篩選自中國(guó)遼寧大連渤海海域近海底泥6～100 m（123。371，E，39。6972，N）；E.coli DH5α 菌株由實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì)粒pMD?19-T Vector Cloning Kit購(gòu)自寶生物工程（大連）有限公司；引物合成和基因測(cè)序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 培養(yǎng)基

LB培養(yǎng)基（1000 mL）：胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，pH 7.0；LB固體培養(yǎng)基需向液體培養(yǎng)基內(nèi)加入 2%（w/v）瓊脂。LA培養(yǎng)基：LB液體或固體培養(yǎng)基中加入終濃度為 100 μg/mL氨芐青霉素。

1.3 低溫幾丁質(zhì)酶chiA基因的克隆

按細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒操作步驟提取菌株P(guān)seudoalteromonas sp. DL-6的基因組DNA。以基因組DNA為模板，根據(jù)NCBI同源序列設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物 ， 正 義 引 物 (5‘-ATGAGCTCACGKAAAATAA TAAMAAATGCC-3‘)， 反 義 引 物 (5‘-TTACAGGC TACAACTTAARSTCCAATC-3‘)，使用 TaKara LA Taq酶擴(kuò)增得到低溫chiA的DNA序列；將該序列連接到pMDl9-T載體，構(gòu)建pMDl9-T-chiA質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至E. coli DH5α，得到陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。再通過(guò) TaKaRa MiniBEST Plasmid Purification試劑盒提取重組質(zhì)粒，以 pMD19-T載體上的測(cè)序引物 BcaBEST Primer M13-47和BcaBEST Primer RV-M測(cè)定重組質(zhì)粒的核苷酸序列。

1.4 低溫幾丁質(zhì)酶chiA基因序列的生物信息學(xué)分析

序列的同源分析通過(guò) NCBI(National Center for Biotechnology Information，http∶//www.ncbi.nlm.nih.gov/)上的 Basic Local Alignment Search Tool (BLAST，http∶//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)完成。采用在線(xiàn)的 Simple Modular Architecture Research Tool(SMART，http∶//smart.embl-heidelberg.de/)進(jìn)行序列結(jié)構(gòu)域分析。采用Discovery Studio分子模擬軟件進(jìn)行同源模建。

1.5 低溫chiA的同源模建

1.5.1 模板蛋白的序列搜索

利用 Discovery Studio中的 BLAST Search(DS Server)模塊，將 chiA的氨基酸序列導(dǎo)入模塊搜索PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)，搜索可以作為chiA同源建模模板的蛋白。根據(jù)搜索結(jié)果，得到與目標(biāo)蛋白同源性最高的晶體結(jié)構(gòu)1ITX。因此本文選取1ITX作為模板，采用同源模建的方法，構(gòu)建目標(biāo)蛋白的空間結(jié)構(gòu)。

1.5.2 模板蛋白與目標(biāo)蛋白進(jìn)行序列比對(duì)

利用Discovery Studio的Align Multiple Sequences模塊進(jìn)行目標(biāo)序列與模板序列的多重序列比對(duì)，設(shè)置新開(kāi)空位罰分 10，延續(xù)空位罰分 0.05，采用BLOSUM參數(shù)矩陣進(jìn)行多重序列比對(duì)運(yùn)算[11]。

1.5.3 基于目標(biāo)序列與模板多重序列比對(duì)的同源模型的構(gòu)建

利用 Discovery Studio平臺(tái)的 Build Homology Models模塊進(jìn)行多模板序列對(duì)目標(biāo)序列的同源建模，載入多重序列比對(duì)結(jié)果，打開(kāi)1ITX模板的PDB文件，參數(shù)設(shè)置中，Number of Models設(shè)置為10，表示同源建模的個(gè)數(shù)為10個(gè)。Optimization Level設(shè)置為 High，表示構(gòu)建模型的效果選擇最佳，這一步會(huì)造成建模時(shí)間的增加，總的建模時(shí)間2小時(shí)56分鐘。

1.5.4 對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行評(píng)價(jià)

通過(guò)Ramachandran plot和Profile-3D兩種方法進(jìn)行模型的評(píng)價(jià)。

Ramachandran plot方法是用于闡述蛋白質(zhì)或肽立體結(jié)構(gòu)中肽鍵內(nèi) α碳原子和羰基碳原子間的鍵的旋轉(zhuǎn)度對(duì)α碳原子和氮原子間的鍵的旋轉(zhuǎn)度，主要用來(lái)認(rèn)識(shí)蛋白質(zhì)或肽類(lèi)中氨基酸的允許和不允許的構(gòu)象。Profile-3D方法采用3D-1D的打分函數(shù)來(lái)檢測(cè)所構(gòu)建模型與自身氨基酸序列的匹配度關(guān)系。分?jǐn)?shù)越高，說(shuō)明同源模型的可信度越大。

2 結(jié)果與討論

2.1 低溫幾丁質(zhì)酶chiA全長(zhǎng)基因的克隆

以Pseudoalteromonas sp. DL-6菌株基因組DNA為模板，利用簡(jiǎn)并引物chiA-F和chiA-R擴(kuò)增出目的片段，大小約為3160 bp（圖1）。與預(yù)計(jì)片段大小相近，切膠回收后測(cè)序，確定為目的基因的保守片段。

圖1 低溫幾丁質(zhì)酶chiA基因的電泳檢測(cè)

2.2 低溫幾丁質(zhì)酶chiA基因生物信息學(xué)分析

低溫chiA全序列進(jìn)行測(cè)序分析可以得出結(jié)論為：該序列全長(zhǎng)3160個(gè)核苷酸，以ATG為起始密碼子，TAA為終止密碼子。該序列編碼1053個(gè)氨基酸構(gòu)成的完整蛋白閱讀框，估算其分子相對(duì)質(zhì)量為113.5KDa，pI值為4.49，將該基因命名為chiA，提交NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)，登錄號(hào)為KF234015。

chiA氨基酸序列提交 SMART進(jìn)行保守結(jié)構(gòu)域分析，結(jié)果顯示見(jiàn)圖2，chiA的N端1-27位氨基酸構(gòu)成信號(hào)肽，N端34-79位和C端1012-1053位氨基酸構(gòu)成類(lèi)型 3幾丁質(zhì)結(jié)合域（type-3 chitin-binding domains，Pfam：PF02839），N 端 102-181位和 194-280位氨基酸構(gòu)成成人多囊腎病結(jié)構(gòu)域（Polycystic Kidney Disease，PKD），323-786位氨基酸為18家族幾丁質(zhì)酶催化域（GH18 catalytic domain），795-987位氨基酸為18家族糖苷水解酶C端部分序列（Pfam：PF06483）。其中1-27位信號(hào)肽的存在表明了假交替單胞菌DL-6分泌表達(dá)幾丁質(zhì)酶蛋白途徑。

圖2 chiA結(jié)構(gòu)圖

本研究chiA除催化域外還包含如幾丁質(zhì)結(jié)合域、成人多囊腎病結(jié)構(gòu)域等結(jié)構(gòu)，這些結(jié)構(gòu)域的功能已有文獻(xiàn)報(bào)道，但機(jī)制闡述得還不是很清楚[12]。chiA在N端和C端存在兩個(gè)類(lèi)型3的幾丁質(zhì)結(jié)合域，根據(jù)Cazy分類(lèi)歸屬于碳水化合物結(jié)合模塊 CBM5或CBM12，但因兩個(gè)家族的蛋白相近蛋白質(zhì)家族數(shù)據(jù)庫(kù)（Pfam；www.pfam.org）歸為一個(gè)家族(PF02839)，即CBM_5_12。據(jù)報(bào)道其對(duì)于糖苷鍵的水解具有非常重要的作用，尤其針對(duì)于晶體粉狀幾丁質(zhì)[13]，主要是其表面的色氨酸與底物作用結(jié)果。幾丁質(zhì)結(jié)合域可能更利于幾丁質(zhì)酶正確定位于催化域、持續(xù)的作用模式和底物脫乙酰作用等方面[14-17]，但至于該結(jié)構(gòu)如何完成底物的有效降解機(jī)理并未完全闡述[15]。通常幾丁質(zhì)酶只具有一個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域，但本研究的 chiA具有兩個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)合域，而且位于幾丁質(zhì)酶的兩端，推測(cè)這種特殊的結(jié)構(gòu)更利于chiA低溫下與底物緊密結(jié)合，低溫下高催化效率、增加底物的彈性降解等功能。有趣的是，本研究的chiA還具有兩個(gè)成人多囊腎病結(jié)構(gòu)域，Orikoshi[18]等人報(bào)道Alteromonassp.strain O-7菌株的幾丁質(zhì)酶A的N端也具有成人多囊腎病結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域通過(guò)兩個(gè)芳香族氨基酸與底物晶體幾丁質(zhì)的緊密結(jié)合而完成高效降解，該結(jié)構(gòu)域不僅能與粉狀幾丁質(zhì)結(jié)合還可以與纖維素和殼聚糖結(jié)合。盡管如此，chiA中的成人多囊腎病結(jié)構(gòu)域是否具有同樣功能還需進(jìn)一步驗(yàn)證。

2.3 低溫幾丁質(zhì)酶chiA的同源模建

為了確認(rèn)chiA催化域保守區(qū)段和催化殘基，針對(duì)催化域利用Discovery Studio軟件進(jìn)行同源模建。

2.3.1 模板蛋白與目標(biāo)蛋白的序列比對(duì)

利用 Discovery Studio中的 BLAST Search(DS Server)模塊，將 ChiA的氨基酸序列導(dǎo)入模塊搜索PDB結(jié)構(gòu)數(shù)據(jù)庫(kù)中，搜索可以作為chiA同源建模模板的蛋白結(jié)構(gòu)。ChiA蛋白全序列比對(duì)未發(fā)現(xiàn)滿(mǎn)足同源模建的序列，只有催化域找到同源性較高的目標(biāo)蛋白，序列比對(duì)結(jié)果見(jiàn)圖3。chiA與模板蛋白催化域的同源性為 29%，相似性 45%。模板蛋白為來(lái)源菌株Bacillus circulansWL-12的幾丁質(zhì)酶 A1的催化域(PDB∶1ITX)滿(mǎn)足同源模建。

圖3 chiA與目標(biāo)蛋白催化域的多重序列比對(duì)

2.3.2 基于目標(biāo)序列與模板多重序列比對(duì)的同源模型的構(gòu)建

如表1所示，通過(guò)Modeller構(gòu)建總共10個(gè)同源建模模型，軟件在模型構(gòu)建好之后會(huì)自動(dòng)進(jìn)行能量的打分。

表1 同源建模構(gòu)建模型的結(jié)構(gòu)能量得分

PDF的函數(shù)值可以直接反應(yīng)出所構(gòu)建模型的好壞，一般PDF Total Energy越小，表明模型能更好地滿(mǎn)足所提取的同源約束條件，模型的可信度也就越大。而 DOPE是一個(gè)基于原子統(tǒng)計(jì)勢(shì)能的程序，也主要用于模型評(píng)估。它的分?jǐn)?shù)可以認(rèn)為是衡量同一個(gè)分子不同構(gòu)象可信度的標(biāo)準(zhǔn)，能夠幫助選擇預(yù)測(cè)結(jié)構(gòu)的最優(yōu)模型，分?jǐn)?shù)越低，模型越可靠。結(jié)合PDF和DOPE結(jié)果我們可以發(fā)現(xiàn)，在軟件的自動(dòng)排序中，尾數(shù)標(biāo)號(hào)為 B99990002排在第一位，說(shuō)明這個(gè)模型在評(píng)分中是最優(yōu)的。

2.3.3 模型評(píng)價(jià)與分析

由圖4拉曼圖譜(Ramachandran Plot)[7]中可以看出藍(lán)色和紫色的區(qū)域站的比例挺大的，區(qū)域外紅色的點(diǎn)的誤差是在允許的范圍內(nèi)，這主要是目標(biāo)蛋白與所有已研究的模板蛋白同源性低的原因所在。

圖4 模型結(jié)構(gòu)的Ramachandran plot圖譜

由Profile-3D結(jié)果可知，多次優(yōu)化后的模型B99990002的整體結(jié)構(gòu)相容性評(píng)分較高，評(píng)分值達(dá)到183.24，遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于預(yù)期低評(píng)分 95.34，故可認(rèn)為優(yōu)化后的模型整體的相容性較為可信。

2.3.4 chiA催化域氨基酸序列分析

從圖chiA的三維結(jié)構(gòu)模型可見(jiàn)，chiA與其他已解析的18家族幾丁質(zhì)酶擁有相似的三級(jí)結(jié)構(gòu)(圖5)，即(βα)8的―T IM”結(jié)構(gòu)。中心部分是平行的β折疊組成的內(nèi)桶，依次為β1～β8，由α螺旋將它們逐個(gè)連接起來(lái)，外桶由 α1-α8組成，內(nèi)外桶緊貼在一起。α螺旋與β折疊之間由一段無(wú)規(guī)卷曲連接起來(lái)。在18家族中高度保守的兩段氨基酸片段相應(yīng)于β3和β4鏈，具有相似的結(jié)構(gòu)。底物結(jié)合的部位就在保守序列β3和β4鏈形成的環(huán)狀縫中。

圖5 菌株DL-6中chiA催化域同源建模結(jié)構(gòu)圖

圖6 chiA催化域與其他生物體的催化域(序列來(lái)源于PDB數(shù)據(jù)庫(kù))多重序列比對(duì)

根據(jù)chiA催化域同源模建模型，結(jié)合DNAMAN軟件對(duì)chiA編碼催化域氨基酸序列與已知晶體結(jié)構(gòu)的幾丁質(zhì)酶催化域的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析結(jié)果(圖6)，研究chiA編碼的催化域氨基酸序列的保守氨基酸殘基信息，推測(cè)chiA催化反應(yīng)機(jī)制。序列比對(duì)分析所選序列包括環(huán)狀芽孢桿菌(Bacillus circulans Wl-12)菌株 Chitinase A1 的 A 鏈(PDB∶ 1ITX_A)，粘質(zhì)沙雷氏菌(Serratia marcescens)菌株幾丁質(zhì)酶B的A鏈(PDB 1E15_A)，哈氏弧菌(Vibrio Harveyi)菌株幾丁質(zhì)酶 A 鏈(PDB∶ 3B8S_A)，粘質(zhì)沙雷氏菌(S.Marcescens)菌株幾丁質(zhì)酶A的A鏈(PDB∶ 1EDQ_A)，食線(xiàn)蟲(chóng)真菌粉紅粘帚霉幾丁質(zhì)酶Crchi1的A鏈(PDB∶3G6L_A)，人類(lèi)殼三糖酶的 A 鏈(PDB∶ 1GUV_A)，哺乳動(dòng)物幾丁質(zhì)酶的A鏈(PDB∶ 3FXY_A)，海洋細(xì)菌(Moritella)低溫幾丁質(zhì)酶的 A 鏈(PDB∶ 4HMC_A)。從圖6可見(jiàn)，盡管不同物種幾丁質(zhì)酶的功能及編碼氨基酸序列差異較大，但其催化域的關(guān)鍵氨基酸是高度保守的。chiA具有18家族糖苷水解酶的兩個(gè)典型保守模塊，分別為99SxGG102和154DxxDxDxE161[19-21]，位于催化域的環(huán)狀縫部位，兩個(gè)保守模塊在已研究的幾丁質(zhì)酶催化活性中心分別負(fù)責(zé)酶與底物結(jié)合及催化降解底物功能。

18家族幾丁質(zhì)酶催化是通過(guò)―底物輔助機(jī)制”，從結(jié)構(gòu)與序列比對(duì)來(lái)看本研究chiA也遵循此底物輔助雙取代水解機(jī)制，導(dǎo)致異頭碳的構(gòu)象發(fā)生改變。154DxxDxDxE161形成即(βα)8桶的β4鏈，構(gòu)成催化域的核心部位，其中谷氨酸(Glu，E161)為酶催化反應(yīng)關(guān)鍵質(zhì)子供體，催化水解-1亞位和+1亞位之間的糖苷鍵，而靠近谷氨酸的兩個(gè)天冬氨酸(Asp，D157和D159)在底物水解過(guò)程中也發(fā)揮關(guān)鍵作用。而 D159被認(rèn)為是反應(yīng)的穩(wěn)定劑，氨基酸側(cè)鏈發(fā)揮以下作用：保證GlcNAc殘基的N乙?；鶊F(tuán)正確結(jié)合在-1位，親核攻擊異頭碳的羰基氧；穩(wěn)定離子中間體 oxazolinium；降低催化氨基酸谷氨酸的pKa。D157被認(rèn)為是穩(wěn)定劑的輔助因子，增加D159的pKa[19,22]。

3 結(jié)論與討論

近年來(lái)幾丁質(zhì)酶的研究已經(jīng)發(fā)展到結(jié)構(gòu)與功能分析等方面，但僅依靠試驗(yàn)不能獲取幾丁質(zhì)酶全部功能信息，故同源建模技術(shù)成為構(gòu)建幾丁質(zhì)酶空間結(jié)構(gòu)，預(yù)測(cè)酶功能的重要手段。本文以1ITX為模板，采用多模板同源建模的方法構(gòu)建了低溫幾丁質(zhì)酶chiA催化域的三維結(jié)構(gòu)。Ramachandram 圖譜檢測(cè)和Verify-3D評(píng)估顯示模擬出的模型結(jié)構(gòu)合理，整體的相容性較為可信。綜合序列比對(duì)、結(jié)構(gòu)域分析與同源模建結(jié)果，表明chiA為糖苷水解酶18家族的一名新成員。根據(jù)chiA催化域同源構(gòu)建模型結(jié)合與其他生物體18家族幾丁質(zhì)酶催化域的多重序列比對(duì)結(jié)果表明，chiA具有 18家族幾丁質(zhì)酶的99SxGG102和154DxxDxDxE161典型模塊，推測(cè)chiA通過(guò)―底物輔助機(jī)制”實(shí)現(xiàn)酶催化反應(yīng)。為進(jìn)一步研究低溫幾丁質(zhì)催化結(jié)晶狀幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系提供了理論依據(jù)，同時(shí)為低溫幾丁質(zhì)酶的進(jìn)一步改造提供理論基礎(chǔ)。

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Cloning, Homology Modeling and Sequecnce Analysis of Cold-Adapted chiA

WANG Xiao-hui, CAO Hong-yu, ZHANG Qing-fang, CHI Nai-yu
（College of Life Science and Technology, Dalian University, Dalian 116622, China）

∶A gene encoding cold-adapted chitinase (GeneBank No.KF234015) was cloned from Pseudoalteromonas sp. DL-6. This complete gene was consisted of 3,160 bp, and encoded a protein of 1,053 amino acids, the predicted molecular mass and pI were 4.49 and 113.5 kD, respectively, named chiA. The analysis of domain indicted that the chiA contained signal, two type-3 chitin-binding domains (ChtBD), two consecutive polycystic kidney disease domains (PKD), a GH18 catalytic domain and partial sequence of chic of GH18. Based on Discovery Studio we built the homology structure and refined the model of catalytic domain of cold-adapted chiA using computer modeling.The diagram of Ramachandram and Verify-3D showed that the model was in accordance with the stereochemistry,and the overall compatibility of this model was credible. The research provided theoretical basis for the further study on catalytic mechanism of cold-adapted chiA.

∶cold-adapted chiA; Pseudoalteromonas sp. DL-6; homology modeling; sequence analysis

Q93/TQ925

A

1008-2395(2015)06-0060-06

2015-03-02

王曉輝（1981-），女，講師，博士生在讀，研究方向：微生物與酶工程。