申貴雋，李雅茹，谷靈燕，趙志偉，弓曉杰

（1. 大連大學 環(huán)境與化學工程學院，遼寧 大連 116622；2. 大連大學 醫(yī)學院，遼寧 大連 116622）

膨大劑分子印跡電化學傳感器的研究

申貴雋1，李雅茹1，谷靈燕1，趙志偉1，弓曉杰2,*

（1. 大連大學 環(huán)境與化學工程學院，遼寧 大連 116622；2. 大連大學 醫(yī)學院，遼寧 大連 116622）

膨大劑（CPPU）為模板分子，鄰苯二胺為功能單體,制備了膨大劑分子印跡傳感器。用循環(huán)伏安法和差分脈沖伏安法法研究了該電極的選擇性和靈敏度。結(jié)果表明，該分子印跡電極對膨大劑分子具有良好的催化作用和選擇性。在pH為4.8的醋酸及其鈉鹽的緩沖溶液中，峰電流與膨大劑濃度在0.05 mg/mL～2.0 mg/mL范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，最低檢出限為0.01 mg/mL。所建立的電化學分析方法操作簡便，可直接用于西瓜中膨大劑含量的測定。

膨大劑；分子印跡；差分脈沖伏安法；鄰苯二胺

0 引言

氯吡脲（Forchlorfenuron，CPPU）俗稱膨大劑，是一種激素類化合物。該物質(zhì)對植物可產(chǎn)生枝干助長、果實速成作用。然而，在種植過程中一旦使用過量就會導致果實外形畸變、品質(zhì)下降、貯藏期短和爛果等不良后果。至于果蔬中殘留的生長激素是否對人體健康產(chǎn)生危害，雖有文獻報道但意見不一，仍是當前果蔬種植、加工和安全檢測行業(yè)亟待探索和驗證的熱門課題[1]。目前對其檢測的報道文獻主要有高效液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用法[2,3]，固相萃?。咝б合嗌V聯(lián)用法[4]、分散萃?。聪喔咝б合嗌V聯(lián)用[5]以及選擇式快速前處理測定[6]等。這些方法雖然精密度和準確度較為理想，但大多涉及貴重的儀器和復雜的操作。

本研究采用電化學高分子薄膜聚合技術(shù)，以膨大劑為模板、鄰苯二胺（OPD）為功能單體在玻碳電極表面制備含有CPPU的鄰苯二胺聚合膜（POPD）、然后再將模板分子洗脫并制備出膨大劑分子印跡電化學傳感器。經(jīng)循環(huán)伏安法和差分脈沖法完成對該電化學傳感器性能的表征。

本研究所建立的分子印跡式傳感測定方法可以在保證上述文獻方法優(yōu)勢的前提下具有簡單、快速、成本低廉、擇性好、抗干擾性強等優(yōu)勢。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

CS300電化學數(shù)據(jù)處理工作站（鄭州合眾儀器有限公司）；三電極系統(tǒng)：玻碳電極（GCE）/自制分子印跡電化學傳感器為工作電極、Ag/AgCl為參比電極、鉑絲電極（天津蘭力科科技發(fā)展有限公司）為輔助電極；KH-500DY型超聲波清洗器（蘇州文良科學儀器有限公司）；PHS-3C酸度計（上海儀電科學儀器股份限公司）；FA1004型電子天平（上海恒平天平儀器有限公司）。

氯吡脲（木木生物科學技術(shù)有限公司），鄰苯二胺（阿拉丁試劑公司），鐵氰化鉀、甲醇、冰乙酸（天津市科密歐化學試劑有限公司），無水乙酸鈉（天津市大茂化學試劑有限公司），a-氧化鋁拋光粉（天津艾達恒晟科技發(fā)展有限公司），DL-組氨酸（國藥集團化學試劑有限公司），DL-懶氨酸（國藥集團化學試劑有限公司）。所有實驗用試劑均為分析純，實驗用水為蒸餾過的去離子水。

1.2 實驗方法

1.2.1 玻碳電極預處理

將GCE在3600#金相砂紙上打磨，之后在麂皮墊上分別用1.0和0.05 μm的Al2O3拋光，再依次用去離子水、HNO3(1：1)、無水乙醇和去離子水分別超聲清洗5 min。然后將清洗后的GCE置于H2SO4（0.5 mol/L）溶液中，以50 mV/s的掃描速度在-0.5～+1.4 V 的電位區(qū)間內(nèi)進行掃描，直至無峰出現(xiàn)為止[7-10]。將電極取出后用去離子蒸餾水沖洗干凈，然后保存于該純化水中備用。

1.2.2 膨大劑分子印跡傳感器的制備

將處理好的玻碳電極置于含0.2 mg/mL膨大劑、0.1 mg/mL鄰苯二胺和pH為4.8的醋酸鈉緩沖溶液中，采用循環(huán)伏安法（設置電位范圍為-0.2V～1.2 V、掃速為50 mV/s），循環(huán)掃描約15圈后既可以在GCE表面聚合生成POPD薄膜。待電聚合反應完成之后，將所得的含有特征薄膜的修飾電極置于1 M鹽酸-甲醇（1∶1，V∶V）混合溶液中，以鐵氰化鉀為探針洗脫模板分子，最終得到了保留有膨大劑構(gòu)型空穴的POPD/GCE分子印跡膜電化學傳感器。在相同的實驗條件下制備不含有模版分子的聚鄰苯二胺薄膜修飾玻碳電極。

2 結(jié)果與討論

2.1 分子印跡敏感膜聚合與表征

按前述實驗方法，采用電化學聚合技術(shù)在基體玻碳電極上制備了聚合物薄膜。膨大劑和鄰苯二胺在玻碳電極表面電聚合過程的循環(huán)伏安曲線由圖1所示。由圖1得知，聚合單體和模版分子在電聚合過程中隨著電化學聚合時間的增加，峰電流不斷降低。這表明該玻碳電極表面已經(jīng)形成致密絕緣的聚合膜（POPD），并且薄膜厚度雖聚合時間增加而增大[11]。由于該薄膜導電性遠遠低于玻碳電極，所以導電性降低、峰電流下降。

從分子組成可以看出，在GCE表面，膨大劑分子中的羥基和聚合鄰苯二胺分子中的氨基將形成氫鍵，從而使CPPU分子嵌入到POPD薄膜之中。在50 mV/s掃速下、-0.2～1.2 V的電位范圍內(nèi)、K3[Fe(CN)6]為探針，分別掃描了 CPPU/POPD/GCE、MIP/GCE和GCE為傳感膜的循環(huán)伏安曲線。由圖2得知，K3[Fe(CN)6]探針在除去模板分子后印跡膜上的峰電流（曲線b）比在裸玻碳電極上的峰電流（曲線a）小得多。而非印跡膜修飾電極經(jīng)甲醇-鹽酸浸泡后仍無電化學活性（曲線 c）。這可能是因為印跡膜的絕緣性，探針離子無法到達GCE表面實現(xiàn)電子傳遞。當印跡膜中的CPPU被洗脫時，膜上留下了印跡孔穴，即而可以作為探針離子電子傳遞的通道，所以MIP/GCE工作電極產(chǎn)生了較低的峰電流（曲線b）。

圖1 分子印跡膜形成過程的循環(huán)伏安曲線

圖2 不同修飾膜電極循環(huán)伏安曲線a-GCE; b-MIP/GCE;c-CPPU/POPD/GCE

上述實驗結(jié)果表明，POPD印跡膜的絕緣性阻礙了電子向電極表面的擴散。在加入模板分子之后，溶液中的CPPU分子中的羥基即與OPD分子中的氨基形成氫鍵而相結(jié)合，由此印跡分子便嵌入了OPD聚合膜中。當用甲醇-鹽酸洗脫該聚合物薄膜中的模板分子 CPPU之后，聚薄膜中便留有一定數(shù)量的與CPPU分子的印跡空穴。該印跡空穴雖然會產(chǎn)生相應的電化學響應，但由于空穴對電荷傳遞的阻礙作用的存在，使其峰電流會低于模板洗脫前的狀態(tài)。

2.2 分子印跡傳感器和非分子印跡電極的對比

在K3[Fe(CN)6]（5 mmol/L）溶液中、-0.2～1.2 V電位范圍內(nèi)，采用DPV法（電位增量5 mV/s，振幅25 mV/s，脈沖周期0.20 s，脈沖寬度50 ms）分別對比測試了分子MIP/GCE與NIP/GCE的電化學性能，結(jié)果如圖3所示。由圖中得知，曲線4的峰電流峰電流最高。這可能是由于GCE表面無傳質(zhì)阻礙作用所致。圖中曲線 1為聚合單體中未加入印跡膜（NIP/GCE）的探針脈沖伏安曲線，其峰電流接近于零。這可能是聚苯二胺的電絕緣性以及聚合膜洗脫后未留下CPPU印跡孔穴，所以探針分子無法通過孔穴與電極接觸，所以導致了峰電流最低。

由曲線3得知，將制備好的膨大劑印跡電極浸入含有CPPU的溶液中吸附一定時間之后，發(fā)現(xiàn)該電極對目標分子響應的峰電流較吸附前（曲線3）出現(xiàn)降低的現(xiàn)象（曲線2）。這可能是由于當CPPU印跡孔穴進行特異性識別的同時，該目標分子也占據(jù)了印跡孔穴。由此可以說明洗脫模版后的分子印跡膜中的空穴對CPPU有一定的選擇性。

圖3 不同電極在鐵氰化鉀探針溶液中的脈沖伏安曲線1-未添加模板分子的 NIP/GCE電極；2-在目標分子溶液中吸附5min后的MIP/GCE電極；3-洗脫2min后的MIP/GC電極；4-GCE電極

2.3 印跡過程原理分析

關(guān)于鄰苯二胺電聚合機理已有相關(guān)推論的文獻[12]，然而在膨大劑作為模版分子條件下的電化學反應機理尚未見報道。依據(jù)待測物與鄰苯二胺的分子結(jié)構(gòu)，可以推測所制備的傳感器具有如下所示的電化學響應機制（方程式中的□符號代表印跡空穴）。

（1）電化學聚合前，反應底液中的鄰苯二胺與膨大劑分子通過氫鍵相結(jié)合：

（2）鄰苯二胺氧化生成陽離子自由基（在電聚合的第一圈時有一個單體的強氧化峰）：

（3）自由基聚合：

（4）二聚體易被氧化：

（5）形成環(huán)狀聚合物：

最后生成聚鄰苯二胺，膨大劑由于分子間的氫鍵作用而嵌入其中：

（6）印跡檢測

當用溶劑將聚合物中的膨大劑模板分子洗脫后，聚合薄膜表面便留下了該分子所印跡的空穴，當其再次與膨大劑溶液相接觸時，在氫鍵力作用下目標分子便與空穴位點發(fā)生印跡式的結(jié)合[9,13]：

2.4 實驗條件條件優(yōu)化

2.4.1 甲醇-鹽酸用量比和模板洗脫時間

甲醇與鹽酸的混合溶液對電極進行洗脫，因兩者的比例不同會對峰電流有影響，因此，分別做了甲醇與鹽酸體積比為 2∶5、3∶5、1∶1、4∶5、5∶2 和 5∶3 對峰電流的影響，如圖4所示，1∶1時峰電流最高。在5 mmol/L的探針溶液中，采用循環(huán)伏安法考察了洗脫時間對模板分子的洗脫效果的影響。圖 5為CPPU/POPD/GCE分別洗脫5～30 min的峰電流曲線，從中可以看出，洗脫時間為25 min時峰電流值最大，因此選擇最佳洗脫時間為25 min。

圖4 甲醇-鹽酸用量比優(yōu)化曲線圖

圖5 洗脫時間優(yōu)化曲線圖

2.4.2 緩沖溶液的選擇和電聚合過程緩沖溶液pH

在相同的實驗條件下，研究了不同聚合物底液中不同支持電解質(zhì)對所制得的膨大劑分子印跡傳感器電活性的影響。將一定濃度的膨大劑與鄰苯二胺分別加入乙酸-乙酸鈉緩沖液和磷酸緩沖液中，然后浸入至K3[Fe(CN)6]溶液中，通過CV法對比二者對印跡膜穩(wěn)定性的影響。由圖 6得知，在乙酸-乙酸鈉緩沖溶液中制得的傳感器印跡膜更加穩(wěn)定，說明該緩沖溶液的pH值對分子印跡膜的形成有著一定的影響。即POPD在酸性條件下聚合較為容易，而在堿性條件下卻會出現(xiàn)印跡膜消失的現(xiàn)象[14]。在4.4～5.6的pH值范圍內(nèi)考察了 pH對峰電流的影響。結(jié)果表明，在pH=4.8時峰形最佳，為此選擇 pH=4.8的乙酸-乙酸鈉緩沖溶液做為測試用電解質(zhì)溶液。

圖6 緩沖液的優(yōu)化曲線圖

2.4.3 單體與模板用量比和膨大劑與緩沖液的用量比

單體與模板用量比較小時，不利于單體之間的聚合，而單體用量過多時又會產(chǎn)生對模板分子的包埋現(xiàn)象，不利于洗脫[15]。試驗中分別考察了苯二胺與膨大劑用量比為 1∶1、1.5∶1、2∶1、2.5∶1、3∶1 條件下的峰電流。結(jié)果表明在用量比為 2∶1時，峰電流最大。膨大劑易溶于甲醇，微溶于水，故本實驗選用甲醇作為溶劑。為此，探討了該膨大劑溶液與緩沖溶液體積比分別為 1∶8、1∶7、1∶6、1∶5、1∶4 和 1∶3 時對峰電流的影響，實驗結(jié)果表明，當比值為1∶6時峰電流最高。

2.4.4 聚合圈數(shù)的選擇

聚合掃描圈數(shù)是影響分子印跡傳感器膜形成的重要影響因素。實驗中以下幾種聚合圈數(shù)：10圈、15圈、20圈、25圈和30圈。實驗結(jié)果表明，在聚合15圈之后的膜質(zhì)量更好、印跡膜表明的活性空穴更多；在掃描10圈的條件下，峰電流較低。這可能是由于聚合時間過短，印跡分子沒有更好的聚合在膜上，從而導致電流響應減弱；當掃描20圈和25圈并洗脫模版后的峰電流與掃描15圈相比沒有明顯增加；且30圈的實驗效果不好，幾乎沒有產(chǎn)生峰電流，所以掃描15圈做為電化學聚合的最佳條件。

2.4.5 掃描速度的選擇

不同掃描速度下制備的聚合物膜電極性能不同。掃描太快，單體來不及擴散到電極表面，生成的聚合物膜薄且不緊密。掃描過慢又會導致薄膜過后。試驗中分別考察了掃描速度20～150 mV/s時的峰電流。結(jié)果表明掃描速度為50 mV/s條件下峰電流值為最大。

2.5 重線性、穩(wěn)定性和工作曲線

在優(yōu)化過的實驗條件下，測定了MIP /GCE 在膨大劑標準溶液中浸泡后對 K3[Fe(CN)6]峰電流的響應曲線。結(jié)果表明，隨著浸泡時間的增加，峰電流逐漸降低，7 min后峰電流基本不變。為此選擇的最佳吸附時間為 7 min。圖 7給出了不同濃度的 CPPU在MIP/GCE電極上的峰電流曲線。濃度在5×10-6～2.0×10-4mg/mL范圍內(nèi)，CPPU濃度與電極峰電流之間具有良好的線性關(guān)系，線性方程為 Ip(μA)＝－1.9537c +4.7949(mg/mL)，相關(guān)系數(shù)為0.9604。相同條件下制備了10支MIP/GCE電極，并且平行測定0.25 mg/mL和2.0 mg/mL的CPPU溶液。該測定結(jié)果的RSD分別為6.85%和1.39%，可見其重現(xiàn)性較好。該傳感器在印跡使用后，經(jīng)過超聲洗脫印跡上的目標分子5 min即可恢復至印跡傳感器狀態(tài)。將用后的膨大劑傳感電極洗凈晾置于空氣中，15天后對CPPU的響應電流降為原來的81%，由此可以得知該傳感器穩(wěn)定性較好。

圖7 不同濃度膨大劑標準溶液在MIP/GCE電極上的CV曲線C（1～7）：0.05，0.1，0.25，0.5，1.0，1.5，2.0 mg/mLCPPU

2.6 分子印跡電極的選擇性

選擇與膨大劑結(jié)構(gòu)類似的DL-組氨酸，DL-懶氨酸作為干擾物質(zhì)，分別考察了對0.25 mg/mL膨大劑測定結(jié)果的影響（表 1）。結(jié)果表明，兩種物質(zhì)的存在對CPPU的檢測基本不會帶來誤差干擾。

表1 膨大劑分子印跡電極的選擇性

2.7 樣品分析及加標回收率實驗

選擇在種植過程中未添加 CPPU的西瓜做為實驗樣品并中加入了已知量的CPPU，然后在前述實驗條件下，用標準曲線法測試了樣品中膨大劑含量和加標回收率。測定結(jié)果表明（表 2），該分子印跡電極可以應用于實際樣品中膨大劑含量的測定，其測定結(jié)果的準確度較為理想。

表2 樣品加標回收率測定結(jié)果

3 結(jié)論

基于電化學聚合方法，以鄰苯二胺為功能基體、在無交聯(lián)劑存在的條件下制備了膨大劑分子印跡傳感器。該傳感器具有較好的選擇性、靈敏度和穩(wěn)定性。實驗結(jié)果表明，膨大劑在該傳感器上的氧化峰電流與其濃度有良好的線性關(guān)系。該分子印跡傳感器可應用于水果及蔬菜中的膨大劑殘留量測定。

[1]朱陣國, 李世平. 陜西獼猴桃種植戶棄用膨大劑意愿影響因素分析——以周至縣為例[J]. 南方農(nóng)業(yè)學報, 2014,45(02)∶ 323-327.

[2]林濤, 鄒艷虹 ,楊旭昆, 等. 超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定葡萄中氯吡脲和噻唑隆殘留及消解[J]. 環(huán)境化學,2014, 33(12)∶ 2210-2211.

[3]吳莉莉, 呂媛媛, 沈兵, 等. 高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速測定水果中氯吡脲殘留量[J]. 理化檢驗∶ 化學分冊,2014, 52(02)∶ 206-209.

[4]羅偉強, 肖小華, 杜卓, 等. 整體柱固相萃取-高效液相色譜法在線分析水果中的氯吡脲[J]. 色譜, 2014, 31(04)∶407-412.

[5]楊柳, 陸軍, 朱杰麗, 等. 基質(zhì)分散萃取—反相高效液相色譜法測定獼猴桃中氯吡脲[J]. 西北林學院學報, 2013,28(02)∶ 156-159.

[6]毛建霏, 雷紹榮, 郭靈安, 等. quechers前處理快速測定豆芽中氯吡脲殘留[J]. 西南農(nóng)業(yè)學報, 2012, 25(04)∶ 1432-1438.

[7]竇元運, 梁斌, 康輝, 等. 抗壞血酸在石墨烯微片修飾玻碳電極上的電化學行為及其測定[J]. 分析試驗室,2013,32(01)∶82-84.

[8]呂逍, 婁長勝, 張偉強, 等. 新型納米鉑修飾玻碳電極的制備及電催化性能研究[J]. 分析試驗室, 2014, 33(04)∶470-473.

[9]趙志偉, 申貴雋, 穆帥, 等. 鹽酸二氧丙嗪分子印跡電極的制備與性能研究[J]. 分析試驗室, 2015, 34(2)∶ 178-181.

[10]申貴雋, 杜宇. 硫酸特布他林分子印跡電極的制備與性能研究[J]. 分析實驗室, 20114, 33(06)∶ 733-736.

[11]張碧紅, 石鎮(zhèn)豪, 申貴雋, 等. 肌苷分子印跡傳感器的制備與性能研究[J]. 山東化工, 2015, 44(08)∶ 12-15.

[12]鄧光輝, 陳盛余, 高靜, 等. 毛細管電泳電化學法分離檢測鹽酸克倫特羅、特布他林和沙丁胺醇[J]. 分析試驗室,2012, 31(02)∶ 25-28.

[13]趙碩, 崔莉鳳, 申晴. 谷氨酸分子印跡電化學傳感器的研究[J]. 環(huán)境科學與技術(shù), 2012, 35(11)∶ 70-74.

[14]劉有芹, 顏蕓, 陳明潔, 等. 聚鄰苯二胺修飾玻碳電極的制備及電催化性能[J]. 化學研究與應用, 2008, 20(11)∶1430-1435.

[15]張進, 田浪, 曹丹, 等. 芐嘧磺隆分子印跡電聚合膜傳感器的制備及性能研究[J]. 分析試驗室, 2013, 32(11)∶ 54-59.

Research of Molecularly Imprinted Electrochemical Sensor for Forchlorfenuron

SHEN Gui-jun1，LI Ya-ru1，GU Ling-yan1, ZHAO Zhi-wei1, GONG Xiao-jie2,*
（1 College of Environmental and Chemical Engineering, Dalian University, Dalian 116622, China; 2. College of Medicine, Dalian University, Dalian 116622, China）

Forchlorfenuron(CPPU) as a template molecule, o-phenylenediamine as functional monomer, preparation and characteristics of molecularly imprinted electrode for forchlorfenuron were studied, set up a new electrochemical analysis method for determination of forchlorfenuron. By cyclic voltammetry and differential pulse voltammetry method to study the selectivity and sensitivity of the electrode, the results showed that the molecularly imprinted electrode had significant catalytic reduction and selective action for forchlorfenuron molecule. In pH=4.8 of acetic acid-sodium acetate buffer solution, the current and the concentration of forchlorfenuron within 0.05mg/mL-2.0 mg/mL showed a good linear relationship, and the minimum detection limit was 0.01 mg/mL. The method was simple, can be used for the determination of content of forchlorfenuron of the watermelon.

forchlorfenuron; imprinting; differential pulse voltammetry; o-phenylenediamine

O657.1

A

1008-2395(2015)06-0005-06

2015-05-21

國家自然科學基金(81172949)。

申貴雋（1957-），男，博士，研究方向：分析化學。

弓曉杰（1963-），男，教授，博士，研究方向：天然產(chǎn)物化學。