王萍亞， 周 勇， 戴意飛， 黃 鸝， 趙巧靈

（舟山市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院，舟山市質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督檢測(cè)研究院，浙江舟山316021）

近年來(lái)，在食品中非法添加和濫用酸性合成色素的現(xiàn)象層出不窮。因此相關(guān)的檢測(cè)方法［1-5］也隨之受到關(guān)注和研究。合成色素與天然色素有著本質(zhì)區(qū)別，合成色素由于色澤鮮艷、容易上色等特點(diǎn)主要應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中。如對(duì)羊毛、皮革、蠶絲等進(jìn)行染色處理，但均有一定程度的毒性。然而有些不法分子為節(jié)省成本，在食品中非法添加酸性合成色素，如酸性黃［6］、酸性紅［7］等，對(duì)人體健康和社會(huì)穩(wěn)定產(chǎn)生了極大的危害。但考慮到酸性合成色素種類繁多，無(wú)法一一列明，因此有必要針對(duì)目前市場(chǎng)上常見(jiàn)的28種酸性合成色素建立篩查方法，從而為有效遏制非法添加行為和食品安全風(fēng)險(xiǎn)預(yù)警提供技術(shù)手段。

目前色素的檢測(cè)方法很多，如毛細(xì)管電泳法［8］、高 效 液 相 色 譜 法［9-11］、液 相 色 譜-質(zhì) 譜法［12-15］等。液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)能夠在一定程度上排除基質(zhì)干擾，對(duì)于基質(zhì)復(fù)雜、需要高靈敏度、寬適用范圍的檢測(cè)工作而言，它已成為最佳的手段之一。四極桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（Q-TOF MS）作為高分辨質(zhì)譜，能測(cè)定得到精確質(zhì)量數(shù)，并且通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行一級(jí)、二級(jí)質(zhì)量數(shù)匹配和同位素匹配等進(jìn)行化合物鑒定，特別是對(duì)非特定的目標(biāo)化合物進(jìn)行鑒定，同時(shí)可以對(duì)檢測(cè)到的陽(yáng)性目標(biāo)物進(jìn)行定量。但目前對(duì)未知添加色素的篩查技術(shù)研究較少，且未見(jiàn)水產(chǎn)品中未知添加色素檢測(cè)的相關(guān)報(bào)道。

因此，本文以水產(chǎn)品為研究對(duì)象，對(duì)其中28種禁用的酸性合成色素進(jìn)行分析，建立了UPLC-QTOF MS篩查方法。對(duì)樣品前處理方法、液相色譜條件、質(zhì)譜條件進(jìn)行了系統(tǒng)優(yōu)化，為水產(chǎn)品中酸性合成色素高通量的篩查和確證提供了可行的方法。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1

儀器與試劑

Agilent UHPLC和Agilent 6540-Q-TOF MS（Agilent，美國(guó)）；Avanti?J-E 高速冷凍離心機(jī)、Talboys渦旋混合器、N-EVAPTM-112氮吹儀、樣品萃取管；甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，均購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；無(wú)水硫酸鎂、乙酸銨、丙酮、正己烷、乙醇和氨水（質(zhì)量分?jǐn)?shù)25%～28%）為分析純；C18填料（40 ～63 μm）、聚酰胺粉（100 ～200目）均購(gòu)自上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司；實(shí)驗(yàn)用水為Milli-Q超純水。

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：莧菜紅（Amaranth，純度89%）、日落黃（Sunset Yellow FCF，純度 90%）、靛藍(lán)（Indigo carmine 91%）、亮黑 BN（Brilliant Black BN，純度91%）、萘酚黃（Naphthol Yellow，純度 89%）、酸性紅（New Coccine，純度 91%）、酸性黃（Acid Yellow，純度89%）、喹林黃（Quinoline Yellow，純度 91%）、酸性紅 2G（Acid Red 1，純度 89%）、亮綠 SF（Light Green SF Yellowish，純度 91%）、偶氮玉紅（Carmoisine，純度91%）、酸性紅26（Ponceau Xylidine，純度91%）、羊毛綠（Wood Green S，純度 91%）、橙色 I（Orange I，純度 91% ）、橙色 II（Orange II，純度91%）、監(jiān)牢綠 FCF（Fast Green FCF，純度 91%）、萘酚藍(lán)黑（Naphthol Blue Black，純度91%）、酸性藍(lán)（Brilliant Blue FCF，純度91%）、酸性紅 52（Sulforhodamine B，純度 91%）、赤蘚紅（Erythrosine，純度91%）、熒光桃紅（Phloxine B，純度 91%）、酸性黃 36（Metanil Yellow，純度 91%）、酸性綠 3（Guinea Green B，純度91%）、熒光素鈉（Uranine，純度 91%）、孟加拉玫瑰紅（Rose Bengal，純度91%）、酸性紅87（Eosin Y，純度91%）、麗春紅 SX（Ponceau SX）均購(gòu)于上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

分別準(zhǔn)確稱取28種酸性合成色素標(biāo)準(zhǔn)品各10 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解，配制成1 g／L的單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液（-20℃保存），再分別吸取1 g／L的28種單標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液各1 mL于100 mL容量瓶中，用甲醇定容得10 mg／L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。用初始流動(dòng)相將其稀釋成相應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，于4℃保存。

1.3 樣品前處理

稱取2.0 g樣品于50 mL帶蓋聚四氟乙烯離心管中，加入10 mL 氨水和乙醇水溶液（2∶7∶1，v／v／v），渦旋混勻后于80℃水浴中濃縮至4 mL，用200 g／L檸檬酸調(diào)節(jié)提取液 pH值至 4.0，以 10 000 r／min冷凍離心10 min，將上清液轉(zhuǎn)移至基質(zhì)分散管中，管內(nèi)裝有氨基化吸附劑（1 000 mg無(wú)水硫酸鎂、50 mg C18粉末、200 mg聚酰胺粉末），振蕩基質(zhì)分散管5 min，以10 000 r／min冷凍離心10 min，去除上清液，然后向沉淀中加入5 mL氨水-甲醇（30∶70，v／v）洗脫，重復(fù)洗脫一次后合并兩次洗脫液，用氨化甲醇定容10 mL，取1 mL用氮?dú)獯蹈?，再?0.2 mL 甲醇-水（50∶50，v／v）溶解，過(guò) 0.22 μm有機(jī)濾膜后供UPLC-Q-TOF MS分析測(cè)定。

1.4 色譜－質(zhì)譜條件

1.4.1 色譜條件

Agilent Eclipse Plus-C （100 mm ×3.0 mm，1.8 μm）作為分析柱，柱溫為30℃；流動(dòng)相A相為5 mmol／L 乙酸銨-0.1% （v／v）甲酸水溶液，B 相為乙腈。梯度洗脫程序：0～1 min，5%B～20%B；1～10 min，20%B ～100%B；10 min～15 min，100%B。進(jìn)樣體積為3 μL；流速為0.2 mL／min。

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子（ESI）源；掃描方式：負(fù)離子全掃描；全掃描范圍：m／z 50～1 100；毛細(xì)管電壓：3 500 V；離子源噴霧電壓：1 500 V；離子化電壓：130 V；鞘氣溫度：350℃；干燥氣溫度：325℃；鞘氣流速：11 L／min；干燥氣流速：8 L／min；數(shù)據(jù)采集模式：全息離子掃描（Allions MS／MS）。參比溶液中含三氯乙酸（C2HF3O2，精確相對(duì)離子質(zhì)量為112.985 5）和六（1H，1H，3H-全氟丙氧基）磷氮的三氟乙酸加合離子（C20H19F27N3O8P+3，精確相對(duì)離子質(zhì)量為1 033.9 881）。

數(shù)據(jù)采集與處理通過(guò)Agilent Mass Hunter Workstation Software （Version B.05.00）軟件完成，碎片離子數(shù)據(jù)庫(kù)建立通過(guò)Agilent Mass Hunter PCDL Manager（B.04.00）軟件完成。

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

選取負(fù)離子模式，在全掃描方式下優(yōu)化離子化電壓、毛細(xì)管電壓、碰撞電壓等參數(shù)。離子化電壓和毛細(xì)管電壓是質(zhì)譜離子源的一項(xiàng)關(guān)鍵參數(shù)，該參數(shù)直接影響目標(biāo)化合物的檢測(cè)靈敏度。隨著離子化電壓和毛細(xì)管電壓的逐漸增大，離子的響應(yīng)強(qiáng)度會(huì)逐漸增強(qiáng)，響應(yīng)達(dá)到一定值后，離子的響應(yīng)又逐漸減弱。本實(shí)驗(yàn)考察了離子化電壓為100～150 V以及毛細(xì)管電壓為3 000～5 500 V的影響，結(jié)果表明在130 V的離子化電壓和3500 V的毛細(xì)管電壓下，所有的目標(biāo)化合物均能夠得到比較滿意的準(zhǔn)分子離子峰，因此本文以130 V作為最佳采樣離子化電壓，根據(jù)優(yōu)化結(jié)果采集數(shù)據(jù)。其次優(yōu)化了碰撞電壓，通過(guò)設(shè)定5～80 V的碰撞電壓，根據(jù)二級(jí)離子靈敏度的總體情況進(jìn)行調(diào)節(jié)，最終選擇了兩個(gè)碰撞能量，低能量值為10 V，高能量為40 V，由于高分辨質(zhì)譜的篩查需要準(zhǔn)確質(zhì)量的二級(jí)圖譜碎片進(jìn)行匹配，所以通過(guò)不同的碰撞電壓進(jìn)行碎裂，并用全息二級(jí)圖譜建立數(shù)據(jù)庫(kù)，最終確定了用于酸性合成色素分析的質(zhì)譜條件，同時(shí)用一級(jí)質(zhì)量數(shù)、同位素豐度和二級(jí)碎片信息等建成一個(gè)完整的數(shù)據(jù)庫(kù)，用于質(zhì)譜篩選。

2.2 流動(dòng)相的選擇

本實(shí)驗(yàn)選擇甲醇-0.1%（v／v）甲酸水溶液、乙腈-0.1% （v／v）甲酸水溶液、甲醇-含 0.1% （v／v）甲酸的5 mmol／L 乙酸銨溶液、乙腈-含0.1% （v／v）甲酸的5 mmol／L乙酸銨溶液作為流動(dòng)相，分析比較了多種酸性合成色素的分離效果。結(jié)果表明，乙腈的分離效果明顯優(yōu)于甲醇，同時(shí)乙腈的洗脫能力更好，提高了分析效率；而乙酸銨能夠得到較好的酸性合成色素峰形，相比之下純水的效果較差；且在乙酸銨溶液中加入0.1%（v／v）甲酸，雖然在負(fù)離子條件下靈敏度有一定程度的損失，但實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其影響在可接受的范圍內(nèi)，同時(shí)峰形和分離度有明顯改善。因此比較了在乙酸銨溶液中添加不同體積分?jǐn)?shù)（0%、0.1%、0.2%、0.5%）的甲酸對(duì)色譜峰的影響，結(jié)果表明含0.1% （v／v）甲酸的5 mmol／L乙酸銨溶液和乙腈為最佳的流動(dòng)相。由此，通過(guò)優(yōu)化質(zhì)譜條件和流動(dòng)相確定最終的采集方法，然后通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)采集獲得28種酸性合成色素的分子特征提取色譜圖（見(jiàn)圖1）。

圖1 28種酸性合成色素的UPLC－Q－TOF MS分子特征提取離子色譜圖Fig.1 Molecular feature of extracted chromatograms of the 28 acidic artificial dyes by UPLC－Q－TOF MS

圖1 （續(xù)）Fig.1 （Continued）

通過(guò)Allions MS／MS模式一次進(jìn)樣同時(shí)檢測(cè)28種酸性合成色素的質(zhì)譜全掃描信息，在化學(xué)工作站設(shè)置28種酸性合成色素質(zhì)譜檢測(cè)的母離子及保留時(shí)間等信息，檢測(cè)得到的質(zhì)譜特征離子如表1所示。

表1 水產(chǎn)品中28種酸性合成色素的保留時(shí)間和質(zhì)譜信息Table 1 Retention times and MS information of the 28 acidic artificial dyes in fishery products

2.3 方法學(xué)驗(yàn)證

2.3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與精密度

配制20～10 000 μg／L的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，以峰面積（Y）對(duì)相應(yīng)的質(zhì)量濃度（X，μg／L）分別繪制28種酸性合成色素的標(biāo)準(zhǔn)曲線。將200 μg／L混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)檢測(cè)6次，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。各酸性合成色素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)（r）和峰面積的RSD見(jiàn)表2。結(jié)果表明，28種酸性合成色素在各自的線性范圍內(nèi)線性關(guān)系良好（r≥0.991）。

表2 28種酸性合成色素的線性范圍、相關(guān)系數(shù)（r）和200 μg／L時(shí)峰面積的RSDTable 2 Linear ranges，correlation coefficients （r）and RSDs of the peak areas of the 28 acidic artificial dyes at 200 μg／L

2.3.2 回收率、檢出限與定量限

根據(jù)3倍、10倍信噪比（S／N）分別確定檢出限（LOD）、定量限（LOQ）。在陰性的鯧魚(yú)樣品基質(zhì)中添加100、200和500 μg／kg 3個(gè)水平的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，按1.3節(jié)方法進(jìn)行預(yù)處理，每個(gè)水平重復(fù)測(cè)定6次，得到28種酸性合成色素的回收率、LOD與LOQ（見(jiàn)表 3）。28 種目標(biāo)物的 LOD 為 5 ～50 μg／kg，LOQ 為20 ～100 μg／kg；且在 3 個(gè)不同加標(biāo)水平下28種酸性合成色素的回收率分別為70.24%～106.47%，可以滿足國(guó)內(nèi)外水產(chǎn)品中酸性色素檢測(cè)的要求。

表3 鯧魚(yú)中28種酸性合成色素的加標(biāo)回收率、RSD、檢出限和定量限Table 3 Recoveries，RSDs，LODs and LOQs of the 28 acidic artificial dyes spiked in Pampus argenteus

表3 （續(xù)）Table 3 （Continued）

2.4 方法的應(yīng)用

選取市售22份水產(chǎn)品（白蟹、富貴蝦、小黃魚(yú)、大黃魚(yú)、龍頭魚(yú)、黃姑魚(yú)、梅童魚(yú)、鮸魚(yú)、玉禿、鯧魚(yú)、帶魚(yú)、青占魚(yú)、馬鮫魚(yú)、鰳魚(yú)、鯖魚(yú)、魷魚(yú)、烏賊、海帶、海蜇、海地瓜、蟶子和文蛤）進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)陽(yáng)性樣品，下一步將以水產(chǎn)品加工品作為采集對(duì)象，擴(kuò)大篩查范圍。按照本方法篩選，以酸性紅為例，圖2是酸性紅的二級(jí)碎片質(zhì)譜圖，可獲得相應(yīng)的母離子和碎片離子信息。經(jīng)過(guò)精確分子質(zhì)量及標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)譜圖數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索，28種目標(biāo)物的匹配度均大于85%，說(shuō)明建立UPLC-Q-TOF MS技術(shù)可快速有效地篩查水產(chǎn)品中28種酸性合成色素。

圖2 酸性紅的二級(jí)碎片圖譜Fig.2 Fragment spectrum of New Coccine

3 結(jié)論

本文建立了UPLC-Q-TOF MS快速篩查水產(chǎn)品中28種酸性合成色素的方法，該方法簡(jiǎn)便快速，靈敏度高，其回收率及重復(fù)性能滿足日常檢測(cè)的要求。采用氨基化吸附劑基質(zhì)分散法對(duì)樣品凈化處理，可有效地減少樣本中雜質(zhì)的干擾。且該方法具有高通量、高靈敏度、高分辨率、高質(zhì)量精確度及可行的線性范圍，可利用四極桿串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜定性的功能，對(duì)28種酸性合成色素進(jìn)行檢測(cè)篩查，適用于水產(chǎn)品中違禁添加色素化合物的快速確證。

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