胡婷婷， 曲曉宇， 康明芹， 宋清蓮， 楊 璐， 趙韞慧， 張代輝*

（1.吉林出入境檢驗檢疫局，吉林 長春130062；2.吉林大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，吉林長春130021；3.吉林大學(xué)第一醫(yī)院，吉林長春130021）

近些年，抗疲勞類保健品（尤其是號稱純中藥成分的保健品）在市場上大量銷售，但由于一些不法分子牟利心切，在中藥保健品中大量非法添加壯陽類化學(xué)成分，對人體造成了很大危害。消費者在不知情的情況下服用這些含有壯陽類化學(xué)成分的保健品，會出現(xiàn)頭暈、惡心、青光眼等癥狀，嚴(yán)重者會造成腎功能、心臟功能及心血管系統(tǒng)的嚴(yán)重損傷［1-3］。因此，有必要建立專屬性強、能快速準(zhǔn)確檢測此類非法添加物質(zhì)的檢測方法。

目前檢測保健品中非法添加物質(zhì)的方法主要有高效液相色譜法（HPLC）及高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（HPLC-MS／MS）等［4-7］。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，高分辨質(zhì)譜越來越受到人們的關(guān)注，與串聯(lián)四極桿質(zhì)譜相比，高分辨質(zhì)譜具有掃描速度快、分辨率高等優(yōu)點［8-12］，但目前在保健品非法添加物質(zhì)的快速篩查方面應(yīng)用仍然較少。

本實驗運用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)，建立了同時檢測抗疲勞類保健品中11種壯陽藥物的方法，操作簡便、快速準(zhǔn)確、結(jié)果可靠。

1 實驗部分

1.1 儀器、試劑與材料

TripleTOFTM5600+系統(tǒng)（AB SCIEX公司），Ekspert ultraLC 100液相色譜儀，AL204電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ5200超聲波清洗器，功率250 W，頻率25 kHz（昆山超聲波儀器有限公司）。

西地那非和他達拉非標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購于加拿大TRC公司，紅地那非、伐地那非、那紅地那非、豪莫西地那非、硫代艾地那非、偽伐地那非、羥基豪莫西地那非、育亨賓、達泊西汀等標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)購于中國食品藥品檢定研究所，所有標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)純度均大于98%。甲醇、乙腈均為色譜純，甲酸為優(yōu)級純，水為去離子水。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)溶液：取上述11種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)各約10 mg，精確稱重至0.1 mg，分別置于10 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得各標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液（約1.0 mg／mL）。實驗時用甲醇稀釋上述混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，配制成不同濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)使用液。

1.3 樣品前處理

1.3.1 口服液、保健酒等液體樣品

本實驗所取口服液樣品均為市售抗疲勞類保健品，準(zhǔn)確吸取0.25 mL待測樣品于25 mL具塞試管中，用甲醇定容至25 mL，混勻后過0.22 μm濾膜，取濾液待測。

1.3.2 片劑、膠囊劑及顆粒劑等固體樣品

本實驗所取片劑、膠囊劑及顆粒劑樣品均為市售抗疲勞類保健品，準(zhǔn)確稱取約0.25 g粉碎均勻的樣品于25 mL具塞試管中，加入約15 mL甲醇，超聲波提取10 min，用甲醇定容至25 mL，過0.22 μm濾膜，取濾液待測。

1.4 色譜條件

色譜柱：Xbridge C18柱（150 mm ×2.1 mm，3.5 μm）；流動相：A為 0.1% 甲酸水溶液，B為0.1%甲酸乙腈，線性梯度洗脫，程序如下：0 min 90%A 10%B，1 min 90%A 10%B，8 min 5%A 95%B，10 min 5%A 95%B，10.1 min 90%A 10%B，15 min 90%A 10%B，共 15 min；流速：0.3 mL／min；柱溫：25 ℃；進樣量：10 μL。

1.5 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧電離源（ESI），正離子模式；掃描范圍：一級質(zhì)譜 m／z 100～1 000，二級質(zhì)譜 m／z 50～1 000；離子源溫度：600 ℃；氣簾氣（CUR）壓力：2.41×105Pa；霧化氣（GS1）壓力：3.79×105Pa；輔助加熱氣（GS2）壓力：3.79×105Pa。11種待測物的保留時間等見表1。

表1 11種待測物的保留時間和精確相對分子質(zhì)量（Mr）Table 1 Retention times and the precise relative molecular masses （Mr）for the 11 anti－impotence preparations

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件和色譜條件的優(yōu)化

根據(jù)待測化合物的結(jié)構(gòu)特征，選擇正離子模式進行質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化。11種待測物在正離子電離模式下均形成［M+H］+準(zhǔn)分子離子峰。

液相色譜條件方面，考察了乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水溶液、0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液等流動相體系，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在0.1%甲酸乙腈-0.1%甲酸水溶液體系中，各化合物峰形較好，且能達到較好的分離效果，因此選其作為流動相，進行梯度洗脫，11種待測物的保留時間見表1，提取離子色譜圖見圖1。

圖1 11種待測物的提取離子色譜圖Fig.1 Extracted ion chromatograms of the 11 anti－impotence preparations For peak Nos.，see Table 1.

2.2 前處理方法的選擇

在檢測工作中我們發(fā)現(xiàn)，中藥成分保健品中添加的非法添加物質(zhì)含量較大，因此在能夠滿足檢出限的情況下采用盡量大的稀釋倍數(shù)，以免儀器受到污染，通過考察甲醇、水、50%甲醇溶液對樣品的提取情況，發(fā)現(xiàn)在使用純甲醇溶解樣品時待測物的峰形較好，且干擾較少，因此選擇用純甲醇作為提取溶劑。由于樣品稀釋倍數(shù)較大，實驗證明基質(zhì)效應(yīng)對11種待測物帶來的影響極小，可以忽略不計，圖2為空白樣品稀釋后的全掃描譜圖。

圖2 空白樣品的全掃描譜圖Fig.2 Full scan chromatogram of a blank sample

2.3 數(shù)據(jù)庫的建立

建立了包括11種非法添加壯陽類化合物的分子式、精確質(zhì)量數(shù)、二級特征碎片離子以及保留時間等信息數(shù)據(jù)庫，通過peakview軟件分別對待測物的一級和二級質(zhì)譜圖與數(shù)據(jù)庫中質(zhì)譜圖進行比對，同時結(jié)合保留時間、母離子、碎片離子精確質(zhì)量數(shù)和同位素豐度比進行比對，用于進一步定性確證。

2.4 方法的線性關(guān)系和定量限

按上述液相色譜及質(zhì)譜條件測定不同質(zhì)量濃度的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，以各組分峰面積對其質(zhì)量濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程和相關(guān)系數(shù)。以信噪比（S／N）等于3的濃度作為該化合物的檢出限，以信噪比（S／N）等于10左右的濃度作為定量限，結(jié)果見表2。

表2 11種待測物的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)（r）、檢出限和定量限Table 2 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients （r），limits of detection （LODs）and limits of quantification （LOQs）for the 11 anti－impotence preparations

2.5 回收率及精密度

向空白樣品（膠囊及口服液保健品）中加入11種待測物對照品溶液，添加水平分別為20.0、50.0和100.0 ng／mL，按實驗方法處理并平行測定6次，計算回收率和精密度。結(jié)果表明，本方法回收率試驗結(jié)果良好（見表3）。

表3 11種待測物的精密度和回收率（n＝6）Table 3 Precisions （RSDs）and recoveries for the 11 anti－impotence preparations （n ＝6）

2.6 實際樣品分析

應(yīng)用本方法對市售20種抗疲勞類中藥保健品進行了檢測，其中口服液3種，保健酒5種，片劑4種，膠囊劑6種，顆粒劑2種。結(jié)果表明，共檢出陽性樣品6個，其中2個樣品（一種為保健酒，另一種為膠囊）檢出西地那非，2個樣品（膠囊）檢出伐地那非，2個樣品（一種保健酒，一種片劑）同時檢出西地那非與他達拉非。

圖3為檢出西地那非的陽性樣品的提取離子色譜圖。

圖3 含有西地那非的陽性樣品的提取離子色譜圖Fig.3 Extracted ion chromatogram of a positive sample containing sildenafil

3 結(jié)論

本文建立了中藥保健品中紅地那非等11種非法添加壯陽類藥物的液相色譜-高分辨質(zhì)譜檢測方法，可實現(xiàn)對11種物質(zhì)的同時定性篩查和定量分析。本方法具有快速、靈敏、高效及選擇性好的優(yōu)點，為食品藥品監(jiān)督部門對抗疲勞類保健品的監(jiān)督和管理提供了可靠的技術(shù)保障，對嚴(yán)格規(guī)范我國保健品市場具有重要意義。

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