張學亮， 羅云敬*， 姜 潔， 路 勇， 馮 楠

（1.北京工業(yè)大學生命科學與生物工程學院，北京100124；2.北京市食品安全監(jiān)控和風險評估中心，北京100041）

β2-受體激動劑（β2-agonists）是一類人工合成的苯乙醇胺類藥物，主要包含克倫特羅、沙丁胺醇、萊克多巴胺等，這類物質的作用包括顯著提高動物胴體的瘦肉率、增重和提高飼料轉化率［1，2］，但對人體有毒害作用。因而，我國農業(yè)部等公告［3-6］規(guī)定嚴禁在動物飼料和飲用水等中使用此類藥物，在動物源食品中不得檢出此類藥物，同時給出了部分藥物的檢測方法。歐盟等西方國家也對食品中部分β2-受體激動劑殘留限量做出了規(guī)定［7］。

食品中β2-受體激動劑殘留的常用檢測方法有高效液相色譜法［8，9］、氣相色譜-串聯(lián)質譜法［10］、高效液相色譜-串聯(lián)質譜法［11］、超高效液相色譜-串聯(lián)質譜法［12-16］等。分子印跡聚合物（molecularly imprinted polymer，MIP）是人工合成的聚合物，是根據(jù)印跡分子定做的，具有特殊的分子結構和官能團，能選擇性地識別印跡分子。所以以分子印跡聚合物為固相萃取吸附劑可提高萃取選擇性。分子印跡固相萃取也逐漸得到很好的應用［15，16］，但是目前國內外尚未見采用分子印跡固相萃取結合液相色譜-串聯(lián)質譜檢測β2-受體激動劑殘留的報道。本研究以豬肉為樣品基質，在55℃酶解2 h后進行分子印跡固相萃取凈化，內標法定量，建立了超高效液相色譜-串聯(lián)質譜同時檢測5種β2-受體激動劑殘留的方法。本方法通過減少酶解時間提高了實驗效率，而且采用內標法定量和分子印跡固相萃取柱進行凈化，進一步提高了方法的準確性。

1 實驗部分

1.1 儀器與試劑

UPLC-TQ-S超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質譜聯(lián)用儀（美國Waters公司）；Milli-Q純水儀（美國Millipore公司）；高速冷凍離心機（美國Sigma公司）；電子分析天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

苯乙醇胺 A（phenethylamine A）、沙丁胺醇（salbutamol）、沙美特羅（salmeterol）、克倫特羅（clenbuterol）、萊克多巴胺（ractopamine）、d6-沙丁胺醇（d6-salbutamol）、d5-萊克多巴胺（d5-ractopamine）、d6-克倫特羅（d6-clenbuterol）、d3-沙美特羅（d3-salmeterol）、d3-苯乙醇胺 A（d3-phenethylamine A）均購自 Dr.Ehrenstorfer GmbH；純度均高于98.0%。β-鹽酸葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶（30 ku／60 ku）購自默克公司；MIP Beta-Receptors固相萃取柱（25 mg／10 mL）購自美國 SUPELCO

標準儲備液的配制：準確稱取25 mg的上述標準品，用甲醇溶解在25 mL容量瓶中，配制成1 000 μg／kg的標準儲備液，于-18℃保存。

乙酸-乙酸鈉緩沖液的配制：稱取43.0 g乙酸鈉，加入22 mL乙酸，用水溶解并定容到1 000 mL，用乙酸調節(jié)pH到5.2。

1.2 樣品制備

樣品的酶解：準確量取動物性食品樣品2 g，置于離心管內，加入1 mg／L的同位素標準溶液20 μL，渦旋混勻，加入 10 mL 0.2 mol／L 乙酸銨緩沖液（pH 5.2）和 100 μL β-葡萄糖醛酸酶／芳基硫酸酯酶，于55℃酶解2 h。酶解液放至室溫后，用0.1 mol／L的NaOH溶液調pH至7.0左右，渦旋后于0℃、10 000 r／min下離心10 min，將上清液轉入50 mL離心管中，待凈化。

樣品的凈化：MIP柱依次用6 mL乙腈、1 mL水活化，然后提取液上MIP柱，棄去流出液；用3 mL水淋洗，抽真空使柱中的溶液全部流出；再用1 mL乙腈、3 mL 60% （v／v）乙腈水溶液淋洗，抽真空使柱中的溶液全部流出；用2 mL 1%（v／v）甲酸乙腈溶液洗脫，收集洗脫液，濃縮至近干，以流動相復溶后過0.22 μm的有機濾膜，待LC-MS測定。

1.3 色譜條件

色譜柱：Waters ACQUITY UPLC HSS C18（100 mm ×2.1 mm，1.7 μm）；流動相：0.1% （v／v）甲酸水溶液（B）／甲醇（A）。梯度洗脫：0～7.0 min，15%A～50%A；7.0～10 min，50%A～99%A；10～13 min，99%A；13.1～16 min，15%A。恒定流速：0.30 mL／min；柱溫：40 ℃；進樣量：10 μL。

1.4 質譜條件

電噴霧離子源正離子（ESI+）模式；毛細管電壓：2.59 kV；離子源溫度：150℃；去溶劑氣溫度：350℃；去溶劑氣流量：800 L／h；錐孔氣流量：150 L／h；多反應監(jiān)測模式。10種β2-受體激動劑的質譜分析參數(shù)見表1。

2 結果與分析

2.1 色譜與質譜條件的優(yōu)化

采用超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質譜分別對5種β2-受體激動劑進行多反應監(jiān)測掃描，以兩對母離子-子離子、保留時間等對這些化合物進行定性、定量。

由于電噴霧質譜的電離是在溶液狀態(tài)下的電保留時間和峰形外，還會影響分析物的離子化效率，從而影響目標化合物的檢測靈敏度。本實驗分別采用甲醇、乙腈、甲醇-0.1% （v／v）甲酸水溶液、乙腈-0.1%（v／v）甲酸水溶液作為流動相，考察了流動相組成對各化合物響應值的影響，結果表明甲醇-0.1%（v／v）甲酸水溶液作為流動相時的峰形明顯改善，因此以甲醇-0.1%（v／v）甲酸水溶液為流動相。最終得到的5種β2-受體激動劑的總離子流圖（total ion chromatogram，TIC）（見圖1）。

表1 10種化合物的質譜參數(shù)Table 1 MS parameters for the ten compounds

圖1 5種化合物的總離子流色譜圖Fig.1 Total ion chromatograms（TIC）of the five compounds

2.2 樣品前處理方法的優(yōu)化

食品中β2-受體激動劑檢測中前處理方法的關鍵是選擇提取效率好的提取溶劑，以及合理的凈化方案，減少目標化合物在樣品前處理過程中的損失。王培龍等［10］、胡艷云等［16］已經對提取溶液進行了很好的研究，本文就酶解條件、凈化方式等條件進行了優(yōu)化。

2.2.1 酶解條件的選擇

β2-受體激動劑在動物體內代謝過程中，多數(shù)會與硫酸酯蛋白和葡萄糖醛酸作用，最終以硫酸軛合物和葡萄糖醛酸軛合物等結合態(tài)形式存在，需要將其轉化為游離態(tài)進行檢測，因此采用β-葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶對樣品進行酶解。參考Damasceno 等［17］、楊光等［18］對 β-葡萄糖醛苷酶／芳基硫酸酯酶的活性研究，本文比較了55℃下酶解2 h和37℃下酶解16 h的效果。結果如圖2所示，因此選擇55℃下酶解2 h。在保證效率和回收率的前提下，本方法與王培龍等［10］、胡艷云等［16］方法以及國家標準［6］等酶解方法相比，提高了工作效率。

圖2 酶解條件對5種β2－受體激動劑回收率的影響Fig.2 Effect of enzyme conditions on the recoveries of the five β2 －agonists

2.2.2 凈化條件的優(yōu)化

實驗過程中發(fā)現(xiàn)，直接用提取劑提取而不凈化時，提取溶液中樣品基質干擾物質多，基質效應比較強，同時對色譜柱和儀器的損壞較大。樣品基質中主要是大分子蛋白質和脂肪，另外也有小分子的碳水化合物等。實驗比較了HLB柱（Waters，6 mL／150 mg，30 μm）、MCX 柱（Waters，6 mL／150 mg，30 μm）、MIP 柱和 DisQuE 凈化管 （Waters，15 mL，150 mg PSA、150 mg C18、900 mg MgSO4），以回收率評價提取效果。如圖3所示，對于DisQuE凈化管、MCX柱、C18柱，由于目標化合物的種類多，極性差異比較大，化合物的保留效果差，損失較大，凈化效果不理想；MIP柱作為相對比較專一的交換柱，能夠特異性地保留目標化合物，采用低溫環(huán)境凈化（-4℃）和強酸條件也能起到沉淀蛋白質和脂肪的凈化作用。所以選擇MIP固相萃取柱。

圖3 不同凈化條件下5種β2－受體激動劑的平均回收率Fig.3 Average recoveries under different purification conditions for the five β2－agonists

2.3 方法的驗證

2.3.1 標準曲線和檢出限

用陰性樣品基質配制 0、0.05、0.1、0.5、1、2、5、10 μg／kg等不同含量的混合標準溶液，同時加入10 μL 1 mg／L的內標物混合液，進行樣品前處理和測定。以5種β2-受體激動劑和內標物的響應比值為縱坐標，化合物的含量（單位為μg／kg）為橫坐標繪制標準曲線。以信噪比為3確定方法檢出限（LOD），信噪比為10確定定量限（LOQ）。5種β2-受體激動劑的線性方程、線性范圍、相關系數(shù)、檢出限和定量限見表2。

表2 5種β2－受體激動劑的回歸方程、線性范圍、相關系數(shù)（r2）、檢出限和定量限Table 2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients （r2），LODs and LOQs of the five β2－agonists

2.3.2 回收率和精密度

如表3所示，在陰性豬肉空白樣品中添加低、中、高3 個水平（0.25、1.0、5 μg／kg）的5 種 β2-受體激動劑混合標準溶液，樣品前處理后測定目標化合物，每個加標水平進行6次試驗。

表3 豬肉加標樣品中5種β2－受體激動劑的平均回收率和相對標準偏差Table 3 Average recoveries and relative standard deviations ofthe five β2－agonists in spiked pork sample

按照實驗室質量控制規(guī)范，當空白樣品中加標水平低于0.1 mg／kg時，回收率和相對標準偏差的要求分別為60%～120%和0～20%。從表3的結果中可以看出，5種β2-受體激動劑的平均回收率為80.4% ～92.9%，相對標準偏差為1.2% ～6.3%，完全符合要求，方法的重現(xiàn)性和準確度良好，較為可靠。

2.4 實際樣品的檢測

利用上述方法對不同地區(qū)大型超市和市場購買的50份豬肉進行分析，只檢出一份豬肉樣品中含有0.13 μg／kg 克倫特羅（見圖4）。

圖4 陽性樣品的色譜圖Fig.4 Chromatogram of a positive sample

3 結論

本研究采用分子印跡固相萃取-超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿質譜技術建立了豬肉中5種β2-受體激動劑殘留的同時定量方法。該方法檢出限低、回收率高，快速、靈敏、準確，提高了實驗效率和準確性，適合同時進行多種β2-受體激動劑殘留的測定。

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