張歡歡， 李 疆， 趙 珊， 丁曉靜*， 王 志

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)理學(xué)院，河北保定071001；2.北京市疾病預(yù)防控制中心，食物中毒診斷溯源技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100013）

乳糖、蔗糖、葡萄糖和果糖是食品中常見糖，也是人體主要能量來源，然而過量攝取糖易導(dǎo)致齲齒和肥胖，嚴(yán)重者可引起代謝紊亂而引發(fā)糖尿病和冠心病等癥［1］。故各類食品中糖的檢測方法研究一直是人們關(guān)注的熱點(diǎn)。

糖的分析方法主要有化學(xué)法及儀器分析法?；瘜W(xué)法測得的是總糖或還原糖，因使用換算公式［2］而導(dǎo)致測定結(jié)果偏高［3，4］，操作步驟繁瑣［5］。儀器法中氣相色譜應(yīng)用相對較少［6］，能夠?qū)崿F(xiàn)多種糖同時(shí)分離與測定的高效液相色譜（HPLC）［5，7-13］和離子色譜（IC）［14-20］逐漸成為食品中糖的主要分析方法。因糖類化合物無特征紫外吸收而給直接紫外檢測造成困難［11］，故文獻(xiàn)報(bào)道的色譜法大多采用示差折光（RI）［8-10］、蒸發(fā)光散射（ELS）［5，7，11］或電化學(xué)（EC）［18］檢測。RI對溫度及壓力變化敏感，預(yù)平衡時(shí)間較長，檢出限通常在g／L量級。盡管ELS的靈敏度比RI高1～2個(gè)數(shù)量級，但易受溫度和氮?dú)饬魉俚挠绊?，對?shí)際樣品的分析結(jié)果并不十分理想。EC的檢測靈敏度比RI和ELS均高，但與其聯(lián)用的IC需使用較昂貴的色譜柱，且大部分色譜柱易受復(fù)雜食品樣品基體的污染，造成較高的分析成本［21］。

糖的強(qiáng)親水性給色譜分離造成了困難［22］，故文獻(xiàn)報(bào)道的HPLC或IC法大多采用梯度洗脫進(jìn)行分離，而分離時(shí)間一般為 30 ～ 50 min［11］，甚至更長［13，18，19］，不利于大量樣品分析。高效毛細(xì)管電泳（HPCE）以其較HPLC高2～3個(gè)數(shù)量級的分離效率而非常適合糖的分析。目前用CE進(jìn)行糖類化合物的檢測有直接檢測、間接檢測和衍生后檢測3種方法，每種檢測方法各有其優(yōu)缺點(diǎn)。本文在文獻(xiàn)工作［23］的基礎(chǔ)上，采用新的分離緩沖體系，建立了毛細(xì)管區(qū)帶電泳（CZE）-間接紫外檢測食品中乳糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的方法。方法分離效率高、耐用。用該法測定了巧克力蛋糕質(zhì)控樣品和9種食品樣品中的4種糖，均獲得了滿意結(jié)果。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器、材料與試劑

P／ACE MDQ毛細(xì)管電泳儀（美國Beckman公司）；Millipore Milli-Elix／RiOs型超純水器（美國Millipore公司）；山梨酸鉀（純度＞99%，梯希愛（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司）；磷酸鈉（Na3PO4·12H2O，分析純）、氫氧化鈉（NaOH，優(yōu)級純）（北京化學(xué)試劑公司）；十六烷基三甲基溴化銨（CTAB，純度≥99%）（美國Sigma-Aldrich公司）；葡萄糖（純度98%）、果糖（純度99%）、蔗糖（純度99%）和乳糖（純度98%）均購自美國Chemservice公司；內(nèi)徑50 μm未涂層熔融石英毛細(xì)管（河北永年銳灃色譜配件有限公司）；英國弗帕斯食品分析水平評估計(jì)劃（FAPAS）巧克力蛋糕質(zhì)控樣品（20110）購自北京中檢維康技術(shù)有限公司；蘋果醋、干紅葡萄酒、雪碧、果珍沖劑、雪梨汁、奶酪、花青素飲料、人參蜂王漿和花粉伴侶等樣品購自超市。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液的配制

準(zhǔn)確稱取0.010 0 g葡萄糖、果糖、乳糖及蔗糖，分別置于1.5 mL塑料離心管中，加入1 mL超純水，渦旋溶解，得到質(zhì)量濃度均為10 g／L的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，4℃冰箱中保存。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)工作液的配制

將4種糖的儲(chǔ)備液分別用超純水稀釋成一系列濃度的混合工作液。其中葡萄糖和果糖工作液的質(zhì)量濃度依次為75、150、300、600 及 1 200 mg／L，乳糖工作液的質(zhì)量濃度依次為 150、300、600、1 200及2 400 mg／L，蔗糖工作液的質(zhì)量濃度依次為300、600、1 200、2 400 及 4 800 mg／L。

1.2.3 樣品前處理

巧克力蛋糕和奶酪：稱取0.10 g樣品，置于15 mL塑料離心管中，加入10 mL 5 mmol／L醋酸，渦旋、超聲 20 min，于 9 000 r／min 下離心 5 min，經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，濾液供分析。

花粉伴侶、固體顆粒沖劑：稱取0.10 g樣品，用5 mL超純水溶解，渦旋混溶，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后進(jìn)樣。

其余樣品直接進(jìn)樣或用超純水稀釋后進(jìn)樣。

1.2.4 電泳條件

毛細(xì)管：30.2 cm（有效長度 20 cm）×50 μm；分離緩沖溶液：4 mmol／L 山梨酸鉀 +10 mmol／L Na3PO4+30 mmol／L NaOH （pH 12.56）+0.5 mmol／L CTAB；分離電壓：-8 kV；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣壓力：3.448 kPa；進(jìn)樣時(shí)間：3 s。新的毛細(xì)管依次用1 mol／L NaOH溶液沖洗20 min、超純水沖洗5 min、分離緩沖液沖洗5 min。每次進(jìn)樣前依次用1 mol／L NaOH溶液、超純水及分離緩沖液各沖洗2 min，以保證方法的重現(xiàn)性。

2 結(jié)果與討論

2.1 探針和檢測波長的選擇

間接紫外法是測定沒有特征紫外吸收物質(zhì)如糖的較為簡單和易行的方法。其中探針及檢測波長的選擇是關(guān)鍵。探針的淌度和濃度是關(guān)系到分離效能的參數(shù)，因?yàn)樗鼈儠?huì)影響峰形及分離效率。探針與分析物的淌度越接近，則峰形越好、靈敏度越高［24，25］。山梨酸鹽、乳糖、葡萄糖、果糖及蔗糖的淌度分別為 3.16 × 10-4cm2／（V ·s）［24］，2.85 ×10-4、3.20 × 10-4、3.22 × 10-4cm2／（V·s）［26］及4.20 ×10-4cm2／（V·s）［25］。4 種糖與山梨酸鹽的淌度相似。故山梨酸是糖分析中比較好的探針，其在256 nm處的摩爾吸光系數(shù)為27 800 L／（mol·cm）［22］。文獻(xiàn)［23］將山梨酸作為紫外探針實(shí)現(xiàn)了蜂蜜中3種糖（葡萄糖、蔗糖及果糖）的同時(shí)分離與測定。但考慮到20℃時(shí)山梨酸在水中的溶解度為0.16%，而山梨酸鉀的溶解度為67.6%［27］，本研究選用了易溶于水的山梨酸鉀作為探針。由于鉀離子（抗衡離子）的存在，山梨酸鉀會(huì)降低檢測靈敏度，但能夠滿足食品樣品中糖的分析需求，因?yàn)樗鶞y食品中4種糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)均大于1%。

為獲得大多數(shù)物質(zhì)的高靈敏度檢出，一般在200 nm 或者 205 nm 波長附近檢測［12］，亦有文獻(xiàn)［23］選用254 nm作為檢測波長，故本實(shí)驗(yàn)比較了檢測波長分別為200、214和254 nm時(shí)4種糖的檢測靈敏度。圖1表明，214 nm檢測時(shí)4種糖的靈敏度低于其他兩個(gè)波長的檢測靈敏度，而200 nm和254 nm的檢測靈敏度差別不大，本實(shí)驗(yàn)選擇254 nm作為檢測波長。

圖1 山梨酸鉀為探針時(shí)4種糖混合標(biāo)準(zhǔn)溶液在不同檢測波長的電泳圖Fig.1 Electrophoregrams of the mixed four carbohydrate standard solution at different detection wavelengths using potassium sorbate as a probe

2.2 探針濃度的選擇

探針濃度一般選擇在2～20 mmol／L，以避免探針濃度過低而引起的電遷移擴(kuò)散導(dǎo)致的峰展寬，以及過高而導(dǎo)致的基線噪聲增加［21，28］。在其他實(shí)驗(yàn)條件不變的條件下，考察了 2、4、6和8 mmol／L山梨酸鉀對4種糖檢測靈敏度的影響。圖2顯示隨著山梨酸鉀濃度的增加，4種糖的遷移時(shí)間均逐漸增加并伴隨電泳峰展寬。綜合考慮分離度及分析時(shí)間，最終選擇山梨酸鉀的濃度為4 mmol／L。

圖2 山梨酸鉀濃度對4種糖分離的影響Fig.2 Effect of the concentration of potassium sorbate on the separation of the four carbohydrates

2.3 分離緩沖溶液體系及其濃度的選擇

糖分子上的羥基具有一定的酸性，能在強(qiáng)堿下解離，解離常數(shù) pKa在 12 ～14 之間［22］。Colón等［29］和 Rizelio 等［23］分別 用 100 mmol／L 和 40 mmol／L NaOH溶液作為分離緩沖溶液，分別實(shí)現(xiàn)了15種糖和3種糖的同時(shí)分離與測定。如此高濃度的強(qiáng)堿溶液一方面不易準(zhǔn)確配制，另一方面pH易受空氣中CO2的影響，生成的碳酸鹽導(dǎo)致分離緩沖溶液的pH發(fā)生改變，故遷移時(shí)間的重現(xiàn)性不好。為保證遷移時(shí)間及定量結(jié)果的重現(xiàn)性，需經(jīng)常更換溶液。

磷酸鹽因本底紫外吸收低、其pKa3=12.36，緩沖范圍在pH 11.36～13.36之間，因而常成為分離常見糖的緩沖體系。間接紫外法需選用低濃度鹽作為緩沖溶液，通?？刂茲舛仍?～10 mmol／L之間［30］；此外，分離緩沖溶液具有緩沖能力的最低濃度一般為10 mmol／L［30］。本研究分別考察了10、15及20 mmol／L磷酸鈉對4種糖分離的影響。如圖3所示，隨著磷酸鈉濃度的增加電滲流降低，4種糖的遷移時(shí)間增加；另外，焦耳熱的增加導(dǎo)致4種糖的靈敏度下降，故磷酸鈉的最佳濃度選為10 mmol／L。

圖3 Na3PO4溶液濃度對4種糖分離的影響Fig.3 Effect of the concentration of Na3PO4solution on the separation of the four carbohydrates

2.4 分離緩沖溶液pH的優(yōu)化

分離緩沖溶液的pH影響電滲流及待分析物所帶電荷，從而影響分析物的遷移時(shí)間和分離效率。在其他實(shí)驗(yàn)條件不變的情況下，考察了磷酸鹽緩沖溶液pH分別為12.30、12.40、12.56及12.60（相應(yīng)NaOH 溶液的濃度分別為20、25、30 及35 mmol／L）時(shí)對4種糖分離的影響。如圖4所示，隨著pH增加，4種糖的遷移時(shí)間減少，乳糖與果糖間的分離度相應(yīng)增加。在保證分離度的情況下，NaOH溶液的濃度越低越好，以避免CO2的干擾。最終確定最佳pH為 12.56，相應(yīng)的 NaOH溶液的濃度為 30 mmol／L。

2.5 毛細(xì)管內(nèi)徑、長度及進(jìn)樣時(shí)間的選擇

兼顧檢測靈敏度和分離度，內(nèi)徑50 μm的石英毛細(xì)管最為常用。由于所測食品中常見糖的質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于1%，故選用50 μm內(nèi)徑毛細(xì)管足以滿足檢測靈敏度的需求。選擇比文獻(xiàn)［23］所用毛細(xì)管（8.5 cm）要長的毛細(xì)管，即采用30.2 cm（有效長度20

圖4 分離緩沖液的pH對4種糖分離的影響Fig.4 Effect of the pH of separation buffer on the separation of the four carbohydrates

cm）毛細(xì)管，獲得了優(yōu)于文獻(xiàn)［23］的分離能力，葡萄糖和果糖可達(dá)基線分離。為避免因進(jìn)樣引起的區(qū)帶展寬，進(jìn)樣區(qū)帶長度應(yīng)不超過毛細(xì)管總長度的2%［31］。利用CE Expert軟件計(jì)算，最佳進(jìn)樣時(shí)間選擇為3 s。

2.6 工作曲線和方法精密度

在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，將上述一系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作液依次進(jìn)樣，校正峰面積外標(biāo)法定量。由表1可見，校正峰面積（y）與質(zhì)量濃度（x，mg／L）間呈良好線性關(guān)系；葡萄糖和果糖的LOD低于文獻(xiàn)［23］的26 mg／L 及 29 mg／L；蔗糖的 LOD 則高于文獻(xiàn)［23］（22 mg／L），但仍能滿足實(shí)際樣品分析的檢測需求。

以FAPAS巧克力蛋糕質(zhì)控樣品（20110）進(jìn)行方法精密度試驗(yàn)，按1.2.3節(jié)樣品前處理方法平行處理7份樣品后進(jìn)樣測定，蔗糖的測定結(jié)果為38.29%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.5%。

2.7 回收率

以僅含乳糖的植物黃油樣品為本底進(jìn)行4種糖的加標(biāo)回收率試驗(yàn)，結(jié)果見表2。

表1 4種糖的線性關(guān)系、檢出限和定量限Table 1 Linear relationships，LODs and LOQs of the four carbohydrates

表2 4種糖的加標(biāo)回收率（n＝5）Table 2 Spiked recoveries of the four carbohydrates（n＝5）

2.8 實(shí)際樣品測定

在對FAPAS質(zhì)控樣品分析并獲滿意結(jié)果的基礎(chǔ)上，用本法對蘋果醋、奶酪等多種樣品進(jìn)行測定，結(jié)果見表3和表4，其中雪梨汁和奶酪的電泳圖見圖5。測定奶制品時(shí)半乳糖干擾乳糖測定，但其他類樣品不受干擾。

圖5 （a）雪梨汁和（b）奶酪樣品的電泳圖Fig.5 Electropherograms of（a）pear juice and（b）cheese samples

表3 液體食品中4種糖的測定結(jié)果（n＝5）Table 3 Mass concentrations of the four carbohydrates in liquid food samples（n＝5）

表4 固態(tài)食品中4種糖的測定結(jié)果（n＝5）Table 4 Contents of the four carbohydrates in solid or sticky food samples（n＝5）

3 結(jié)論

采用毛細(xì)管區(qū)帶電泳-間接紫外法，以簡單的磷酸鹽分離緩沖體系，在10 min（預(yù)清洗6 min；分離4 min）內(nèi)即可完成4種糖的同時(shí)分離與測定。樣品前處理簡單（僅需用水或醋酸提?。?，降低了檢測成本，提高了實(shí)際樣品的分析速度，可獲得精密而準(zhǔn)確的分析結(jié)果。本方法適用于食品中乳糖、蔗糖、葡萄糖和果糖的同時(shí)測定。但該方法測定奶制品中乳糖時(shí)，半乳糖干擾其測定。

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