高瑞峰 施月桃

(長春科技學(xué)院,吉林長春 130600)

奶牛乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)

高瑞峰 施月桃

(長春科技學(xué)院,吉林長春 130600)

從荷斯坦奶牛乳房無菌采取乳腺組織,以組織塊培養(yǎng)法,建立成熟的奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系,觀測長出的上皮細(xì)胞在各生長時期的形態(tài)變化,純化奶牛乳腺上皮細(xì)胞。結(jié)果表明:組織塊接種可以得到大量細(xì)胞用于原代培養(yǎng),從而可以進(jìn)行后期的體外實(shí)驗(yàn)。

乳腺上皮細(xì)胞;分離;組織塊培養(yǎng)

1 材料

1.1 奶牛乳腺組織來源

奶牛乳腺組織塊采自健康的泌乳期荷斯坦奶牛（來源于長春市皓月屠宰場）。用無菌手術(shù)剪剪取乳腺組織，置于 37℃生理鹽水中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 主要試劑及儀器

DMEM/F12、胎牛血清、胰蛋白酶（Trypsin，1：250）、青霉素100 IU/ml、鏈霉素100 IU/ml，生化培養(yǎng)箱，光學(xué)顯微鏡，激光共聚焦顯微鏡（奧林巴斯）等。

2 方法

2.1 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)

2.1.1 奶牛乳腺組織培養(yǎng)前的處理

（1）一部分乳腺組織用4% 甲醛溶液固定；另一部分乳腺組織用于乳腺上皮細(xì)胞的分離培養(yǎng)。

（2）用37℃生理鹽水將用于細(xì)胞分離培養(yǎng)的乳腺組織洗滌數(shù)次，直至清除組織中所有的血跡、乳汁及其他雜質(zhì)。

（3）在無菌操作臺中，先用無菌的手術(shù)剪將乳腺組織周圍脂肪和結(jié)締組織去除，使乳腺腺泡暴露出來。

（4）將獲得的腺泡組織在75% 酒精中浸潤約 1min，再用0.01M PBS（含有100IU青霉素和100IU鏈霉素）洗滌 3 次。

（5）將腺泡組織置于無菌的青霉素小瓶中，用無菌的小眼科剪將其剪切成約 1mm3大小的組織塊，備用。

2.1.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞組織塊培養(yǎng)法

（1）將上述剪切完全的乳腺組織塊用牙科探針平鋪于體積為50ml 的卡氏細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，植塊間距為 0.5cm，應(yīng)盡量使乳腺組織塊的切面向下粘附于細(xì)胞培養(yǎng)瓶壁上。

（2）經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)瓶側(cè)壁緩慢加入 5ml DMEM/F-12（含10%FBS）細(xì)胞培養(yǎng)液，蓋緊瓶蓋。

（3）將有組織塊的一面朝上，37℃培養(yǎng)箱中靜置 2～3h 后，使組織塊微干。

（4）將卡氏細(xì)胞培養(yǎng)瓶翻轉(zhuǎn)過來，使組織塊完全浸沒于細(xì)胞培養(yǎng)液中，每3d 更換一次新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液，待細(xì)胞密度為90%時，無菌條件下用牙科探針將組織塊完全去除，沖洗換液。

2.2 奶牛乳腺上皮細(xì)胞的形態(tài)學(xué)觀察

奶牛乳腺上皮細(xì)胞37℃ 培養(yǎng)24h后，在光學(xué)顯微鏡下觀察乳腺上皮細(xì)胞形態(tài)學(xué)并照相。

3 結(jié)果

奶牛乳腺上皮細(xì)胞在24～48h內(nèi)貼壁，其形態(tài)由圓形逐漸呈多角形，具有典型上皮細(xì)胞形態(tài)。37℃培養(yǎng)72h后，細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)板，呈單層鋪路石狀，如下圖。

奶牛乳腺上皮形態(tài)學(xué)觀察

[1] 丁月云，張莉莉，陳莎莎，等.組織塊種植法體外培養(yǎng)奶牛乳腺上皮細(xì)胞[J].南京農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報，2008，3l（4）：91-96.

[2] 王治國，王傳蓉，王加啟.不同方法分離奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)的研究[J].乳業(yè)科學(xué)與技術(shù)，2009，（1）：35-38.

[3] Kadegowda AK，Bionaz M，Piperova L S，et a1.Peroxi—some proliferator··activated receptor··gamma activationand long·chain fatty acids alter lipogenie genenetworksin bovine mammary epithelial cells to various extents[J].J Dairy Sci，2009，92（9）：76-89.

[4] 陳建暉，佟慧麗，李慶章，等.奶牛乳腺上皮細(xì)胞系的建立[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2009，40（5）：743-747.

[5] 崔立莉.奶牛乳腺上皮細(xì)胞體外培養(yǎng)體系的建立及其應(yīng)用[D].新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)，2006.