韓毅 彭浩

兩種方法檢測(cè)LGC盲樣及效果探討

韓毅 彭浩

目的 檢測(cè)LGC盲樣中的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌并對(duì)過程和結(jié)果進(jìn)行探討。方法 ①分離培養(yǎng)法。②實(shí)時(shí)熒光PCR法。結(jié)果 兩者均檢出小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌。結(jié)論 兩種方法的有效結(jié)合對(duì)目標(biāo)菌檢出有更重要的意義。

盲樣；小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌；分離培養(yǎng)法；實(shí)時(shí)熒光PCR法

小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌是一種人獸共患的腸道病原菌，20世紀(jì)80年代才受到人們的重視，不少地區(qū)耶氏菌引起的胃腸炎和嚴(yán)重腹瀉，比痢疾還多。1981年我國(guó)才發(fā)現(xiàn)此病，通過全國(guó)性調(diào)查和研究，發(fā)現(xiàn)其在我國(guó)的分布非常廣泛，80年代中期證實(shí)過曾有兩次大流行[1]。本菌是一種嗜冷菌，在0～4℃仍能繼續(xù)繁殖并產(chǎn)生毒素。在冰箱內(nèi)存放的污染該細(xì)菌的食品對(duì)人仍具有感染性[2]。鑒于小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的危害性，很多國(guó)家都已將該菌列為食品的常規(guī)檢測(cè)項(xiàng)目。本檢測(cè)中心為了提高中心實(shí)驗(yàn)室的小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢測(cè)能力，向英國(guó)LGC申請(qǐng)?jiān)摼膰?guó)際盲樣考核，并通過常規(guī)鑒定法和PCR法對(duì)該盲樣進(jìn)行了實(shí)驗(yàn)。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本來源 英國(guó)LGC(Laboratory of the Government Chemist政府化學(xué)家實(shí)驗(yàn)室)提供的凍干粉25 g。

1.2 培養(yǎng)基、試劑及儀器

1.2.1 分離培養(yǎng)法的培養(yǎng)基、試劑及儀器 改良磷酸鹽緩沖液(PSB)、CIN-1培養(yǎng)基、改良Y培養(yǎng)基、改良克氏雙糖培養(yǎng)基、尿素酶、動(dòng)力半固體、糖發(fā)酵管由北京陸橋試劑有限公司提供；API鑒定系統(tǒng)、API-20E生化試劑條及其配套試劑，VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀及VITEK2-GN鑒定卡購(gòu)自法國(guó)梅里埃公司。

1.2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR法試劑及儀器 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌核酸測(cè)定試劑盒 (實(shí)時(shí)熒光PCR法)購(gòu)自上海之江生物科技有限公司；AB 7500 FAST型Real-Time PCR儀購(gòu)自美國(guó)杜邦公司。

1.3 方法

1.3.1 分離培養(yǎng) 無(wú)菌操作稱取25 g凍干粉放入裝有225 mL改良磷酸鹽緩沖液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，26℃增菌72 h，參照食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)小腸結(jié)腸炎耶爾森菌檢驗(yàn)方法(GB/T4789.8－2008)[3]進(jìn)行。取增菌液作堿處理，分別接種到CIN-1平板、改良Y平板上，26℃培養(yǎng)48 h。挑取可疑菌落接種改良克氏雙糖，并做初篩的生化鑒定(尿素酶、鼠李糖、26℃和37℃培養(yǎng)下動(dòng)力)，符合以上反應(yīng)者用API－20E生化試劑條和VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀做進(jìn)一步的生化鑒定。

1.3.2 實(shí)時(shí)熒光PCR法 從上述分離培養(yǎng)的26℃增菌72 h的改良磷酸鹽緩沖液中取出2 mL，用離心管13 000 rpm離心2 min，去盡上清；在沉淀中加入100 μL DNA提取液充分混勻，沸水浴10 min；13 000 rpm離心5 min，取上清4 μL與小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌核酸熒光PCR檢測(cè)混合液35 μL、內(nèi)部對(duì)照品1 μL、酶(Taq+UNG)0.4 μL，振蕩混勻數(shù)秒，3 000 rpm離心數(shù)秒，立即進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。設(shè)置循環(huán)參數(shù)：37℃×2 min；94℃×2 min；再按93℃×15 sec→60℃×60 sec，循環(huán)40次，單點(diǎn)熒光檢測(cè)在60℃。同時(shí)進(jìn)行陽(yáng)性對(duì)照品、陰性對(duì)照品試驗(yàn)。循環(huán)結(jié)束后，觀察熒光曲線。

2 結(jié)果

2.1 分離培養(yǎng)結(jié)果 在CIN－1瓊脂平板上多為紅色、周圍帶較小透明環(huán)的菌落或紅色無(wú)透明環(huán)的菌落。所有菌落均較為圓整，但大小不一，雖都為紅色，但略有色差。在改良Y瓊脂平板上多為無(wú)色透明、不黏稠的菌落，大小不一，也是略有色差。根據(jù)經(jīng)驗(yàn)推斷，該盲樣中混入了除目標(biāo)菌外的其他雜菌。因此，對(duì)CIN-1平板、改良Y平板上的多個(gè)不同菌落均進(jìn)行分離純化，挑取形態(tài)最接近目標(biāo)菌的菌株進(jìn)行鏡檢和生化初篩。初篩的生化鑒定中，改良克氏雙糖接種管產(chǎn)酸不產(chǎn)氣、尿素酶陽(yáng)性、鼠李糖陰性、26℃培養(yǎng)下有動(dòng)力，37℃培養(yǎng)下無(wú)動(dòng)力。將該疑似菌落用API-20E生化試劑條和VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀進(jìn)行鑒定。兩者鑒定結(jié)果均為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌，API-20E可靠性為95%(表1)，VITEK2可靠性為99%(表2)。

表1 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌API－20E生化試劑條鑒定結(jié)果

表2 小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌VITEK2全自動(dòng)細(xì)菌鑒定儀鑒定結(jié)果

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果 (圖1) 盲樣的熒光曲線在21個(gè)循環(huán)處呈光滑的上升拋物線，峰值出現(xiàn)在在Delta Rn 1.0e+006左右處。陽(yáng)性對(duì)照品的熒光曲線在10個(gè)循環(huán)處呈光滑的上升拋物線，峰值同樣出現(xiàn)在在Delta Rn 1.0e+006左右處。陰性對(duì)照品則呈不規(guī)則的折線圖。比較陽(yáng)性對(duì)照品的熒光曲線和盲樣的熒光曲線可以判斷盲樣為小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢出。

圖1 實(shí)時(shí)熒光PCR結(jié)果

3 結(jié)論

我國(guó)現(xiàn)階段食品中小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測(cè)主要以傳統(tǒng)分離培養(yǎng)為主，它是所有檢測(cè)方法的金標(biāo)準(zhǔn)。但是按照國(guó)標(biāo)上的方法進(jìn)行培養(yǎng)時(shí)間較長(zhǎng)，檢測(cè)完成周期也較長(zhǎng)。而且從CIN-1平板、改良Y平板上的菌落形態(tài)來看，有些非目標(biāo)菌同國(guó)標(biāo)上小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的描述也很吻合。在此次的盲樣考核中，作者就受到了很大的干擾。在CIN-1平板上分離出與小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌菌落形態(tài)很相似的一種菌，通過染色鏡檢，初步生化，最終生化，才確定其是一種大腸埃希氏菌。由于此類雜菌和目標(biāo)菌的競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致目標(biāo)菌在選擇性平板上生長(zhǎng)的很少，這就給分離檢出帶來了困難。實(shí)時(shí)熒光PCR方法由于具有實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)程、快速、特異性強(qiáng)以及靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)而成為國(guó)外目前檢驗(yàn)該菌的主要方法。但由于食品體系較復(fù)雜且雜菌率較高以致檢出率較低，所以在使用實(shí)時(shí)熒光PCR方法檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌之前增菌是十分必要的[4]。在經(jīng)過PSB的增菌以后，使用實(shí)時(shí)熒光PCR進(jìn)行擴(kuò)增，從熒光曲線結(jié)果來看，單位容積內(nèi)的DNA數(shù)量有明顯的呈指數(shù)級(jí)的擴(kuò)增現(xiàn)象，而將未經(jīng)增菌的PSB凍干粉溶液擴(kuò)增后結(jié)果顯示基本為陰性。將這兩者直接轉(zhuǎn)種至CIN-1平板上時(shí)，前者跟后者一樣都很難直接分離出目標(biāo)菌，原因可能是PSB在增菌的過程中選擇性并不是很強(qiáng)，目標(biāo)菌和雜菌都在大量的生長(zhǎng)，而雜菌在CIN-1平板上的生長(zhǎng)又優(yōu)于目標(biāo)菌，導(dǎo)致平板上的目標(biāo)菌菌落過于稀少，這就給分離檢出帶來了困難。而將PSB增菌液進(jìn)行堿處理后的效果就好的多，在CIN-1平板上也較容易分離出目標(biāo)菌。因?yàn)橐疇柹暇鷮?duì)弱堿具有較高的抵抗力，用弱堿液迅速處理15 s，可以殺死大部分不耐堿的其他細(xì)菌，能提高小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢出率[5]。

綜上所述，實(shí)時(shí)熒光PCR法檢測(cè)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌速度快，周期短，但是普遍共知的是PCR法雖然靈敏度高，但是易出現(xiàn)結(jié)果的假陽(yáng)性和假陰性。傳統(tǒng)分離培養(yǎng)雖然周期長(zhǎng)，操作繁瑣且要求檢測(cè)人員有豐富的經(jīng)驗(yàn)，但是其檢測(cè)的穩(wěn)定性和把握性也更高。目前的有利條件是引進(jìn)了全自動(dòng)生化鑒定儀，這就給后期的確證帶來了極大的方便和保證。兩種方法均有自己的優(yōu)勢(shì)與不足，如何將兩種方法有機(jī)的結(jié)合，創(chuàng)造出一套切實(shí)有效的操作模式，為我們的檢測(cè)工作服務(wù)，這還有待于我們的進(jìn)一步思考和研究。

[1]于恩庶.中國(guó)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌病研究進(jìn)展[J].中華流行病學(xué)雜志，2000，21(6)：453-455．

[2]龔霄，陳盼.肉中革蘭氏陰性食源性致病菌[J].肉類研究，2008，22(5)：32-46.

[3]中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部.食品衛(wèi)生微生物學(xué)檢驗(yàn)小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌檢驗(yàn)[S].北京：中國(guó)標(biāo)準(zhǔn)出版社，2008．

[4]牛蕾，祝長(zhǎng)青，周光宏，等.小腸結(jié)腸炎耶爾森菌前增菌方式的選擇[J].食品科學(xué)，2011，32(5)：168-171．

[5]張昕，張惠媛，汪琦，等.小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌的檢測(cè)[J].檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2008，18(6)：23-26

Objective To detect Yersinia enterocolitica in LGC blind sample and probe into the process and results.Methods ①Isolated culture method.②Real-time fluorescence PCR method.Results Yersinia enterocolitica was detected by both methods.Conclusion The effective combination of the two methods has more important significance to detect Yersinia enterocolitica.

Blind sample；Yersinia enterocolitica；Isolated culture；Real-time fluorescence PCR method

2014-05-06)

1005-619X(2015)01-0087-03

10.13517/j.cnki.ccm.2015.01.046

214023無(wú)錫市疾病預(yù)防控制中心