李婭　支崇遠　孫翠翠等

摘要：對不同濃度Cd2+中淡水底棲硅藻Nitzschia amplectens的存活數(shù)、葉綠素a含量及運動速度進行測定，以探索硅藻對重金屬毒性的響應規(guī)律，為硅藻監(jiān)測水體污染提供科學依據(jù)。純化培養(yǎng)Nitzschia amplectens，生長數(shù)量達到7萬個/mL時，加入不同濃度的Cd2+進行急性毒性和亞急性毒性脅迫培養(yǎng)。在急性毒性試驗中，Nitzschia amplectens的存活數(shù)在96 h的EC50值為4.989 mg/L。在亞急性毒性試驗中，培養(yǎng)15 d后Cd2+濃度為0.625、0 mg/L的Nitzschia amplectens運動平均速度為2.5、5.56 μm/s，其余試驗組無運動跡象；培養(yǎng)13 d后，Cd2+濃度與葉綠素a含量呈負相關（P<0.05）。Cd2+濃度對Nitzschia amplectens的生長、運動速度和葉綠素a含量有明顯影響，所以Nitzschia amplectens具監(jiān)測水體重金屬Cd2+污染潛力。

關鍵詞：Nitzschia amplectens；重金屬Cd2+；培養(yǎng)；生長；運動；葉綠素a；水質監(jiān)測；指示生物

中圖分類號： Q945.78；X832 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0305-03

鎘是一種生物毒性很強的重金屬，能在有機體內積蓄，通過食物鏈傳遞富集可引起生物體生長緩慢甚至死亡[1]。隨著工業(yè)的發(fā)展，大量的Cd2+向環(huán)境中排放，使得環(huán)境中的Cd2+污染加重。中國水體鎘污染時有發(fā)生，2012年1月15日廣西龍江河宜州拉浪段發(fā)現(xiàn)重金屬鎘超標，至1月21日18時污染事件已造成約28.1萬尾魚死亡。目前鎘已被美國毒理管理委員會（ATSDR）列為第6位危及人體健康的有毒物質，被聯(lián)合國組織確定為優(yōu)先檢測的環(huán)境污染物[2]。

底棲硅藻是一種單細胞生物，分布很廣，是水體中的初級生產者，在光合作用下它們吸收水中的無機鹽和二氧化碳，制造有機物[3-4]，它們對凈化水質具有重要意義。2000年歐共體水框架指南（Water Framework Directive of the European Union）推薦硅藻為水體監(jiān)測生物指標。底棲硅藻對許多環(huán)境變量（pH值、光、鹽度、溫度、無機營養(yǎng)濃度等）敏感[5-6]，它們與水體重金屬關系的研究已有一些報道。Nitzschia amplectens Hustedt是中國西南地區(qū)河流中常見淡水底棲硅藻，其與重金屬關系的系統(tǒng)研究報道甚少。探索Nitzschia amplectens與Cd2+的關系，可為生物監(jiān)測水質增加新的內容。

1 材料與方法

1.1 藻種

藻種Nitzschia amplectens Hustedt采集于貴州省烏江上游畢節(jié)市七星關區(qū)層臺鎮(zhèn)玉龍鄉(xiāng)河流中段。

1.2 儀器設備

主要儀器有顯微鏡（NIKON EOLIPSE 50i）、生化培養(yǎng)箱（SPX-250）、水浴鍋、超凈工作臺、離心機和微量移液器等。

1.3 底棲硅藻自制培養(yǎng)基

1.3.1 培養(yǎng)基基礎液 培養(yǎng)基基礎液配制見表1。

1.3.2 土壤浸出液配制 稱取500 g土壤（土壤采集于貴州省貴陽市相寶山地區(qū)），去離子水1 L，混合后用塑料薄膜封口，沸水浴加熱1 h，冷卻，離心，過濾，取上清液，加蒸餾水至總體積1 000 mL，置于10.1 MPa高溫下滅菌30 min，保存于 4 ℃ 備用。

1.3.3 Nitzschia amplectens培養(yǎng)基 將配制好的培養(yǎng)基基礎液與土壤浸出液以一定的比例混合，用NaOH液將pH值調至7.5±0.5，經(jīng)0.2 μm濾膜，滅菌，得到Nitzschia amplectens培養(yǎng)基。

1.4 純化培養(yǎng)和脅迫培養(yǎng)

1.4.1 Nitzschia amplectens的分離及純化培養(yǎng) 將野外采集的硅藻樣品帶回實驗室，用50目的篩絹過濾水樣，放于顯微鏡下觀察，采用微吸管分離法，通過多次抓取，將Nitzschia amplectens藻種分離出來，即可將此放入自制培養(yǎng)基中在培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

培養(yǎng)條件：溫度（24±1） ℃，光照周期12 h ∶12 h，光照度1 800 lx。每天12：00和19：00搖動藻液1 min，以防硅藻附在玻璃壁上。

1.4.2 Cd2+急性毒性脅迫培養(yǎng) 09：00—10：00在顯微鏡下用血球計數(shù)板統(tǒng)計藻密度，當藻種數(shù)量達到約7萬個/mL時，用 500 mL 的培養(yǎng)瓶分裝藻液，進行擴大培養(yǎng)，培養(yǎng)條件同“1.4.1”節(jié)。

取7個100 mL培養(yǎng)瓶（1個對照組+6個試驗組），加入藻液40 mL，藻液密度為7萬個/mL，再分別在各培養(yǎng)瓶中滴加 Cd2+液，7個瓶中Cd2+濃度最終調節(jié)依次為0、0.5、1、2、5、10、15 mg/mL，重復3次。按“1.4.1”節(jié)培養(yǎng)條件培養(yǎng)，在培養(yǎng)后0、24、48、72、96 h取樣，用血球計數(shù)板計數(shù)，所得數(shù)值通過計算得出96 h EC50值。先算出抑制率X：X=（I0-I）/I×100%（式中：I0為Cd2+濃度為0時的特定生長率；I為試驗組特征生長率），通過SPSS的Probit分析計算得出EC50。

1.4.3 Cd2+亞急性毒性脅迫培養(yǎng) 取5個500 mL培養(yǎng)瓶（1對照組+4試驗組），放入藻液200 mL，藻液密度7萬個/mL，試驗組Cd2+濃度梯度設置為96 h EC50、96 h EC50/2、96 h EC50/4、96 h EC50/8[7]，對照組為空白。進行亞急性毒性培養(yǎng)（培養(yǎng)條件同“1.4.1”節(jié)）。觀察期為15 d，前3 d每天09：00取樣1次，之后每隔2 d取樣1次，每次取樣為10 mL，共計9次，對所取藻液進行葉綠素a含量的測定及對硅藻運動情況觀測。endprint

隨著Cd2+脅迫培養(yǎng)時間的延長，Cd2+對Nitzschia amplectens生長的抑制作用增強。96 h的EC50值為4.989 mg/L，根據(jù)藻類生長抑制毒性分級標準[9]可知，Cd2+對Nitzschia amplectens屬于高毒，對其生長的抑制作用較大。

2.2.2 Cd2+濃度對Nitzschia amplectens運動狀態(tài)的影響 由于硅藻的生殖方式為二分裂生殖，藻的體積會減小，運動情況也會受到影響，所以總體運動趨勢處于緩慢下降。由圖2可知，經(jīng)過15 d的Cd2+脅迫培養(yǎng)，Cd2+濃度對Nitzschia amplectens的運動的抑制作用十分明顯。1 d后，藻的運動速度與Cd2+濃度呈負相關關系，其一元回歸線性方程為y=-0.409x+3.584（P<0.05），在Cd2+濃度為2.495 mg/L的藻液中，所有藻就已停止運動（Cd2+濃度為4.989 mg/L的藻液中，所有藻停止運動，未在圖2中標出）；在Cd2+濃度為1247 mg/L的藻液中培養(yǎng)7 d后，藻也停止了運動。由此可見，Cd2+濃度對Nitzschia amplectens的運動速度有很大的影響。

2.2.3 Cd2+對Nitzschia amplectens葉綠素a含量的影響

藻類的光合作用與其體內葉綠素的含量密切相關，葉綠素的含量若受到影響，則會影響藻細胞的生長，因此有必要對在Cd2+脅迫培養(yǎng)下的菱形藻的葉綠素a含量進行測定。由圖3可知，在不同濃度Cd2+的條件下對藻培養(yǎng)15 d，前3 d 葉綠素a的總含量變化不是很大；培養(yǎng)后5 d，Cd2+濃度為4.989 mg/L的生長抑制率達到最大，葉綠素a總含量下降。5 d后，Cd2+濃度為4.989、2.495、1.247 mg/L藻液中的葉綠素a含量基本不再增加，對照組的葉綠素a含量則明顯增加，說明Cd2+對該種菱形藻的的葉綠素a含量有一定影響。計算13 d后葉綠素含量與Cd2+濃度相關系數(shù)r=-0.797，呈負相關關系，一元回歸線性方程為y=-0.251x+4.782（P<0.05），說明Cd2+濃度對藻光合作用能力有一定影響，且隨著培養(yǎng)時間和Cd2+作用時間的延長而增加影響力度。

3 結論與討論

生物監(jiān)測是理化監(jiān)測的重要補充，用生物監(jiān)測進行配合，充分利用指示生物對污染物毒性反應的敏感性，便能較準確地反映真實的污染狀況[10]。菱形藻為污水藻，本試驗對象選取菱形藻屬中的Nitzschia amplectens，該種生物對重金屬響應的報道極少，而它又是中國西南河流中常見的硅藻種。因此，希望通過本試驗可以提供一些科學數(shù)據(jù)。在預試驗培養(yǎng)時使用f/2培養(yǎng)基、土壤浸出液以及土壤浸出液和培養(yǎng)基基礎液混合液作為培養(yǎng)基，經(jīng)觀察得出使用土壤浸出液與培養(yǎng)基礎液按一定比例混合后用作培養(yǎng)基中的藻數(shù)量增長最快，藻的運動情況較好，因此，將其作為本試驗中Nitzschia amplectens的培養(yǎng)基。將通過分離和純化培養(yǎng)得到純種Nitzschia amplectens用于不同濃度的Cd2+藻液中進行急性毒性試驗和亞急性毒性脅迫培養(yǎng)試驗，測定96 h EC50、葉綠素a含量及其運動的平均速度，并對這些測定數(shù)據(jù)進行分析。藻液中的Cd2+濃度與對該藻生長呈負相關關系，且隨著時間的延長，特別是亞急性毒性脅迫培養(yǎng)試驗5 d后，Cd2+濃度對該藻的葉綠素a含量及運動狀況的影響程度明顯逐漸增強，該反應可用于水環(huán)境的檢測。

目前，國內外已對多種硅藻受單一重金屬脅迫的影響進行了大量研究[11]，將20世紀90 年代之后微藻受單一重金屬脅迫的LC50或EC50值進行總結，但尚未見Nitzschia amplect的EC50研究報道。若對比該藻種在Cd2+脅迫培養(yǎng)與其他硅藻[如三角褐指藻（Pheodactylum tricornutum）、新月菱形藻Nitzschia closterium等]的96 h EC50值，其值明顯較大[12]，說明Nitzschia amplectens對Cd2+耐受程度較弱，對Cd2+濃度變化反應敏感，可用于監(jiān)測水體中的重金屬Cd2+含量。

一般情況下，重金屬對藻類生理、生化功能的影響主要表現(xiàn)在抑制光合作用、減少細胞色素、導致畸變以及改變天然環(huán)境中藻類的組成。此外，有關藻類的DNA、RNA、蛋白質合成及酶活性等方面也有報道[13]。本試驗對Nitzschia amplectens在 15 d 內進行不同濃度Cd2+亞急性毒性脅迫培養(yǎng)，結果顯示，藻的葉綠素a含量的增加受到明顯抑制。邱昌恩研究發(fā)現(xiàn)，重金屬離子能通過阻礙光合作用電子傳遞，抻串4蛋白質合成，對藻細胞線粒體形成損傷使葉綠體變形[14]，如葉綠體收縮、類囊體膨脹、基粒結構解體、基質減少、質體小球大量增加等現(xiàn)象[15-16]，從而降低了藻細胞中的葉綠素a的含量。藻細胞生存生長的能量來源于光合作用，而光合作用發(fā)生在葉綠體片層中。類囊體膜上含有各種光臺色素，光合片層基質中含有光合作用暗反應所需的酶系統(tǒng)，光合片層受損，意味著光合作用酶系統(tǒng)受到影響，能量轉化無法順暢完成，導致細胞生長受到影響，從而必定會影響藻的運動。

通過多次試驗觀察發(fā)現(xiàn)，在09：00—10：00期間，Nitzschia amplectens 最活躍，因此將試驗情況觀察時間定在這一時段。Cd2+濃度為4.989、2.495 mg/L時，所有藻停止運動，因此Cd2+濃度最高點設定在2.495 mg/L。通過觀測運動情況發(fā)現(xiàn)，Cd2+對Nitzschia amplectens運動速度有很大的影響，可能是胞外蛋白聚糖（EPS）與硅藻運動有關[17-18]。今后可以深入開展Nitzschia amplectens胞外產物與運動情況相關的試驗。

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