牟向欣

TB-DNA、分枝桿菌快速培養(yǎng)和T-SPOT.TB及聯(lián)合檢測對結(jié)核性腦膜炎的診斷價值

牟向欣

目的 探討TB-DNA、分枝桿菌快速培養(yǎng)和T-SPOT.TB對結(jié)核性腦膜炎(tuberculosis meningitis TBM簡稱“結(jié)腦”)的診斷價值。方法 回顧性分析了2012年3月～2014年11月已確診的106例初治結(jié)腦患者腦脊液（cerebrospinalfluid,CSF）的TB-DNA、分枝桿菌快速培養(yǎng)及T-SPOT.TB檢測結(jié)果，并收集了45例非結(jié)腦的CSF作為對照組，對結(jié)果進(jìn)行比較分析。結(jié)果 結(jié)腦組的TB-DNA、分枝桿菌培養(yǎng)、T-SPOT.TB、TB-DNA+分枝桿菌快速培養(yǎng)聯(lián)合檢測的檢測方法的敏感性分別為23.1%、21.8%、80.9%和45.5%，在非結(jié)腦組中其特異性分別為100%、100%、88.9%和100%。結(jié)論 T-SPOT.TB敏感性最高，TB-DNA+分枝桿菌培養(yǎng)聯(lián)合檢測也可以提高檢出率，為結(jié)腦早期診斷及治療提供有效的輔助檢查依據(jù)。

TB-DNA；BD 960分枝桿菌快速培養(yǎng)；T-SPOT.TB；腦脊液

結(jié)核性腦膜炎(tuberculosis meningitis TBM，簡稱“結(jié)腦”)是神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病最常見的類型，發(fā)病率約占全身結(jié)核的

6%，由于其早期診斷困難，延誤率和死亡率均較高，尤其是北方邊遠(yuǎn)山區(qū)發(fā)病率甚高，是結(jié)核病死亡的主要原因[1]。由于腦脊液（celebrospinalfluid，CSF）涂片的陽性率僅為10%，因而需要一個結(jié)腦臨床診斷更客觀實用的依據(jù)。本研究收集了2012年3月2014年11月共106例臨床已確診的結(jié)腦初治患者，通過回顧分析這些結(jié)腦患者的TB-DNA、BD 960分枝桿菌快速培養(yǎng)、T-SPOT.TB的檢測結(jié)果，進(jìn)而探討這幾種檢測方法對結(jié)腦的診斷價值?，F(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 結(jié)核性腦膜炎組 本研究106例患者全部為遼寧省錦州市傳染病醫(yī)院結(jié)核區(qū)2012年3月～2014年11月住院治療且診斷明確的結(jié)腦患者。入選標(biāo)準(zhǔn)參考Skinner等和Ahuja等的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)：（1）急性、亞急性或隱匿性起病，多伴有頭痛、發(fā)熱、嘔吐等腦膜刺激癥狀或伴有局灶性神經(jīng)損害體征；（2）CSF的常規(guī)和生化均有淋巴細(xì)胞比例增加、蛋白定量逐漸升高等特異性改變。（3）CT或MRI檢查表現(xiàn)為腦水腫、肉芽腫或滲出。（4）抗結(jié)核藥物治療有效。其中男67例，女39例，年齡5～64歲，且12例有腦外結(jié)核原發(fā)灶，5例抗酸菌涂片陽性。經(jīng)抗結(jié)核治療，好轉(zhuǎn)或治愈者97例，9例死亡。

1.1.2 非結(jié)核性顱內(nèi)感染組 為2013年12月～2014年11月在錦州市中心醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科住院治療的非結(jié)核性腦膜炎患者，共45例，男31例，女14例；年齡12～75歲。根據(jù)相應(yīng)診斷標(biāo)準(zhǔn)，病毒性腦膜炎25例，化膿性腦膜炎18例，新型隱球菌性腦膜炎2例。

1.2 儀器與試劑 （1）TB-DNA檢測方法：儀器為杭州博日科技有限公司的熒光定量PCR檢測系統(tǒng)Bioer LineGene 9620，試劑為杭州博奧生物有限公司提供的晶芯分枝桿菌核酸檢測試劑盒（PCR-熒光探針法，產(chǎn)品編號為301031），CSF標(biāo)本經(jīng)核酸提取、加入擴(kuò)增液等步驟采用PCR和TaqMan探針技術(shù)快速完成結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌的鑒別診斷（具體步驟詳見儀器及試劑操作說明書）。（2）分枝桿菌快速培養(yǎng)：儀器為美國BD公司的BACTEC MGIT BD 960分枝桿菌快速培養(yǎng)儀，培養(yǎng)基為美國BD公司的MGIT液體培養(yǎng)基，CSF標(biāo)本按操作流程在生物安全柜內(nèi)直接接種于MGIT培養(yǎng)管中，然后置入BD 960分枝桿菌培養(yǎng)儀中，儀器報警陽性后，將陽性培養(yǎng)管取出直接涂片進(jìn)行抗酸染色以確定是否為分枝桿菌。（3）T-SPOT.TB檢測方法：試劑盒T-SPOT.TB和單個核細(xì)胞分離管由深圳達(dá)科為生物技術(shù)有限公司提供，實驗過程嚴(yán)格按照試劑盒說明書操作進(jìn)行，結(jié)果判定依據(jù)斑點數(shù)，0～5個為陰性，標(biāo)本A和B斑點數(shù)-陰性對照斑點數(shù)≥6個為陽性。

1.3 方法

1.3.1 對106例結(jié)腦患者進(jìn)行回顧性資料收集，其中有78例進(jìn)行過CSF的TB-DNA檢測，55例進(jìn)行過CSF的分枝桿菌培養(yǎng)實驗，47例進(jìn)行過CSF的T-SPOT.TB檢測，其中有44例同時進(jìn)行過TB-DNA和分枝桿菌培養(yǎng)實驗。

1.3.2 對45例非結(jié)腦對照組的CSF同時進(jìn)行三項檢測（儀器、試劑及方法同上述106例）。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 13.00軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)計算與分析，計數(shù)資料以百分率表示，采用χ2檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

結(jié)腦患者CSF中的TB-DNA、分枝桿菌快速培養(yǎng)、T-SPOT.TB、TB-DNA+分枝桿菌培養(yǎng)聯(lián)合檢測結(jié)果如表1所示。TB-DNA、分枝桿菌快速培養(yǎng)、T-SPOT.TB、TB-DNA+分枝桿菌快速培養(yǎng)聯(lián)合檢測的敏感性分別為23.1%、21.8%、80.9%和45.5%。T-SPOT.TB敏感性最高，對CSF TB-DNA陽性或陰性的敏感性分別為91.5%、75.7%，對CSF 結(jié)核菌培養(yǎng)陽性或陰性的敏感性分別為92.3%、80.7%，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。對照組中，45例中有3例化腦患者的CSF是T-SPOT.TB陽性，特異性為88.9%，其余特異性均為100%，相比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義。見表1。

表1 4種方法檢測結(jié)果

3 討論

T-SPOT.TB技術(shù)是2001年由Lalvani［2]等發(fā)明，利用結(jié)核桿菌感染患者外周血或腦脊液單個核細(xì)胞中特異性活化T細(xì)胞，這些單個核T細(xì)胞在受到結(jié)核桿菌特異性抗原刺激后分泌干擾素-γ而設(shè)計的T細(xì)胞試驗，通過計數(shù)斑點可以推測體內(nèi)是否存在對結(jié)核桿菌反應(yīng)的T細(xì)胞，從而對結(jié)核桿菌感染進(jìn)行輔助診斷。此項技術(shù)可以從60×103個分泌干擾素-γ的T細(xì)胞中檢測到一個細(xì)胞［3]。隨著這一技術(shù)的不斷完善和發(fā)展，在結(jié)核病診斷方面，T-SPOT.TB技術(shù)不止應(yīng)用于外周血，在腦脊液、胸腹水［4-5］等標(biāo)本的檢測也取得了滿意效果。Kim等[6]于2007年在韓國率先對結(jié)核性腦膜炎患者的腦脊液及外周血進(jìn)行T-SPOT.TB檢測，以明確其敏感性及特異性，結(jié)果腦脊液的敏感性及特異性均為75%，本次各組CSF試驗結(jié)果經(jīng)比對，T-SPOT.TB敏感性為最高，為80.9%（38/47），特異性為88.9%，略高于Kim等的報導(dǎo)，但低于國內(nèi)相關(guān)報導(dǎo)[6]。其中有腦外結(jié)核原發(fā)灶的12例標(biāo)本T-SPOT.TB皆為陽性。由此可看出，T-SPOT.TB有較高的靈敏度和特異性，對臨床結(jié)腦特別是初發(fā)患者，具有較高的應(yīng)用價值，只是由于成本較高致費用偏高，不適合作為篩查必檢項目在臨床普及。

PCR技術(shù)也是近年來廣泛應(yīng)用于臨床的檢測手段，特別是其高敏感性、高特異性和快速性備受臨床認(rèn)可，可檢出少量菌、異質(zhì)和異型菌，特別是CSF標(biāo)本的TB-DNA檢測，當(dāng)CSF中的TB涂片和分枝桿菌培養(yǎng)為陰性時，若TB-DNA為陽性也可為臨床提供結(jié)腦的診斷依據(jù)，并可區(qū)分結(jié)核和非結(jié)核分枝桿菌，且特異性好于T-SPOT.TB技術(shù)。本文單一檢測CSF中的TB-DNA和分枝桿菌快速培養(yǎng)的敏感性分別為23.1%（18/78）和21.8（12/55），相對較低，和以往關(guān)于CSF中的TB-DNA檢測的研究[7-8]有差異，可能主要是本次研究的病例都為結(jié)腦初治患者，只有9例患者病情較重，其他患者病情都相對較輕，CSF抗酸菌涂片只有5例陽性，由于CSF中結(jié)核菌含量本來就偏少，致TBDNA檢測和分枝桿菌快速培養(yǎng)的敏感性偏低。但若兩項聯(lián)合檢測，則敏感性可以提高到45.5%（20/44），且特異性很好，對結(jié)腦的臨床診斷和鑒別診斷也有一定的臨床價值。

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Objective To discuss the diagnosis value of TB-DNA、Mycobacterium rapidly develop、T-SPOT.TB and the combination in tubercular meningitis(TBM). Methods To analyse retrospecively the test results of TB-DNA、Mycobacterium rapidly develop and T-SPOT.TB of CSF in 106 tuberculous meningitis which were treated fi rst from March 2012 to November 2014, as well collected 45 CSF in non- tuberculous meningitis patients as contrast group , then carried on comparative analysis. Results The sensibility of TB-DNA、Mycobacterial culture、T-SPOT.TB and TB-DNA + Mycobacterium rapidly develop were 23.1%，21.8%，80.9% and 45.5% in tuberculous meningitis group , The specif i city were 100%，100%，88.9% and 100% in non- tuberculous meningitis group. Conclusion The sensibility of T-SPOT.TB was the highest,TB-DNA + Mycobacterium rapidly develop can increase the detection rate, and provide effective and assistant method for early diagnosis and treatment of tuberculous meningitis.

TB-DNA ; Mycobacterium rapidly develop;T-SPOT.TB; Cerebrospinalf l uid

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.14.031

遼寧 121017 遼寧省錦州市傳染病醫(yī)院檢驗科（牟向欣）

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