李曉英 陳麗娟 郭惠萍 強(qiáng)萍

葉酸代謝酶基因多態(tài)性與反復(fù)自然性流產(chǎn)易感性的研究

李曉英 陳麗娟 郭惠萍 強(qiáng)萍

目的 探討葉酸代謝酶關(guān)鍵酶基因多態(tài)性與反復(fù)自然性流產(chǎn)的易感性。方法 采用基因測(cè)序技術(shù)檢測(cè)60例反復(fù)自然性流產(chǎn)和150例正常妊娠的婦女亞甲基四氫葉酸還原酶MTHFR C 677 T、A 1298 C和甲硫氨酸合酶還原酶MTRR A 66 G的基因多態(tài)性。結(jié)果 流產(chǎn)組MTHFR C 677 T等位基因頻率中T所占比率30.0%（36/120）明顯高于對(duì)照組21.3%（64/300）（P＜0.05）；自然性流產(chǎn)組MTHFR A 1298 C基因型頻率中CC所占比率13.3%（8/60）高于對(duì)照組3.3%（5/150）（P＜0.05）；等位基因頻率中C所占比率35.8%（43/120）明顯高于對(duì)照組24.7%（74/300）（P＜0.05）；MTRR A 66 G基因等位基因頻率中G所占比率33.3%（40/120）明顯高于對(duì)照組25.3%（76/300）（P＜0.05）。結(jié)論 與正常妊娠的婦女比較，反復(fù)自然性流產(chǎn)婦女的MTHFR基因A 1298 C、C677 T兩個(gè)位點(diǎn)和MTRR A66 G位點(diǎn)基因的突變基因頻率明顯增加，MTHFR基因和MTRR基因的多態(tài)性的檢測(cè)可作為反復(fù)自然流產(chǎn)患者的臨床診斷指標(biāo)。

反復(fù)自然流產(chǎn)；亞甲基四氫葉酸還原酶；蛋氨酸合成酶還原酶；多態(tài)性；易感性

反復(fù)自然性流產(chǎn)是指連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的自然流產(chǎn)，是妊娠期常見并發(fā)癥之一，發(fā)病率為1%～2%，占所有妊娠丟失的15%～20%[1]。目前研究發(fā)現(xiàn)，胎盤動(dòng)脈栓塞所致的胚胎血供不足、絨毛壞死是自然習(xí)慣性流產(chǎn)發(fā)生的重要原因之一，而高同型半胱氨酸血癥是血液高凝狀態(tài)及相關(guān)疾病的的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[2-4]。高同型半胱氨酸代謝相關(guān)酶基因突變是導(dǎo)致葉酸代謝障礙和高同型半胱氨酸血癥的遺傳性因素，因此，很多學(xué)者都將焦點(diǎn)集中在影響葉酸及同型半胱氨酸的代謝、轉(zhuǎn)運(yùn)的基因上。研究表明，亞甲基四氫葉酸還原酶(Methylenetetrahydrofolate，MTHFR)及甲硫氨酸合酶還原酶(Methionine synthase reductase，MTRR)基因存在多種基因多態(tài)性位點(diǎn)，其中最常見的是MTHFR基因的C 677 T、A 1298 C和MT RR的A 66 G[5]，而這些基因的突變與血清中葉酸、維生素B12及血同型半胱氨酸水平關(guān)系密切[6]。本研究旨在探討MTHFR C 677 T、A 1298 C和MTRR A 66 G基因與反復(fù)自然性流產(chǎn)的易感性進(jìn)行。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選取2013年5月～2015年5月張家港市第一人民醫(yī)院收治的反復(fù)自然性流產(chǎn)非孕期患者60例為本次研究對(duì)象。其中，年齡20～36歲，平均年齡（25.3±3.5）歲。所有患者診斷標(biāo)準(zhǔn)符合第8版《婦產(chǎn)科學(xué)》[7]有關(guān)反復(fù)自然性流產(chǎn)的診斷。同時(shí)選擇同期150例正常妊娠的婦女作為對(duì)照，年齡21～35歲，平均年齡（23.2±4.1）歲。

1.2 方法

1.2.1 試劑與設(shè)備 采用Ta q m a n-M G B技術(shù)對(duì)MTHFR基因C 677 T、A 1298 C和MTRR基因A 66 G位點(diǎn)的單核甘酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism,SNP）分型進(jìn)行檢測(cè)。相關(guān)儀器、試劑均購(gòu)自美國(guó)ABI公司。反應(yīng)所用的基因多態(tài)位點(diǎn)引物信息見表1。

表1 反應(yīng)所用的基因多態(tài)位點(diǎn)引物信息

1.2.2 樣本DNA提取及葉酸基因分型 樣本DNA采集：提取受檢者的口腔黏膜上皮細(xì)胞，利用柱式抽提試劑盒抽提樣本DNA。采用基因測(cè)序技術(shù)，檢測(cè)MTHFR C 677 T、MTHFR A 1298 C和MTRR A 66 G的基因多態(tài)性。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用統(tǒng)計(jì)學(xué)SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，計(jì)數(shù)資料用例數(shù)（n）表示，計(jì)數(shù)資料組間率（%）的比較采用χ2檢驗(yàn)；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 MTHFR C 677 T基因型頻率和等位基因頻率 自然性流產(chǎn)組MTHFR C 677 T基因型頻率中CT、TT、CC所占比率與對(duì)照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；等位基因頻率中T所占比率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 2組MTHFR C 677 T基因型頻率和等位基因頻率分布情況［n（%）］

2.2 MTHFR A 1298 C基因型頻率和等位基因頻率 自然性流產(chǎn)組MTHFR A 1298 C基因型頻率中AA、AC所占比率與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CC所占比率稍高于對(duì)照組（P＜0.05）；等位基因頻率中C所占比率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 2組MT HFR A 1298 C基因型頻率和等位基因頻率分布情況［n（%）］

2.3 MTRR A 66 G基因型頻率和等位基因頻率 自然性流產(chǎn)組MTRR A 66 G基因型頻率中AG、GG所占比率、AA所占比率與對(duì)照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；等位基因頻率中G所占比率明顯高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 2組MT RR A 66 G基因型頻率和等位基因頻率分布情況［n（%）］

3 討論

葉酸是同型半胱氨酸代謝途徑的一個(gè)重要物質(zhì)，葉酸代謝途徑的正常運(yùn)轉(zhuǎn)在維持DNA正常甲基化和DNA從頭合成以及DNA修復(fù)中是至關(guān)重要的[8]。若控制葉酸代謝的關(guān)鍵酶基因突變，其活性將顯著降低，直接影響DNA低甲基化，導(dǎo)致染色體畸變[9]。早在1990年國(guó)外學(xué)者Libbus等就報(bào)道了對(duì)倉(cāng)鼠卵培養(yǎng)中發(fā)現(xiàn)缺乏葉酸的培養(yǎng)組的倉(cāng)鼠染色體畸變率(包括染色體裂隙、染色體斷裂等)是正常倉(cāng)鼠的10倍[10]。其原因?yàn)檠獫{中有缺陷的葉酸代謝可能會(huì)導(dǎo)致DNA合成、參與胚胎形成過程中DNA甲基化受損。且如果體內(nèi)葉酸缺乏，5-甲基四氫葉酸生成減少，同型半胱氨酸復(fù)甲基化通路受阻，體內(nèi)同型半胱氨酸水平也蓄積升高。所以，出生的缺陷的發(fā)生不僅與葉酸缺乏有關(guān)，還與同型半胱氨酸升高密切相關(guān)。

MTHFR和MTRR是葉酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程中關(guān)鍵的酶，這些酶基因多態(tài)性是過去十多年來的研究熱點(diǎn)，與先兆子癇、胎兒生長(zhǎng)受限、死胎、唇腭裂、反復(fù)自然流產(chǎn)、胎兒畸形發(fā)生等不良孕產(chǎn)結(jié)局有關(guān)[11-13]。MT HFR基因包括10個(gè)內(nèi)含子和11個(gè)外顯子，位于1號(hào)染色體短臂，現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)近二十種基因多態(tài)性突變位點(diǎn)，其中以A 1298 C、C 677 T兩個(gè)位點(diǎn)的研究最多而備受關(guān)注。MTHFR第7個(gè)外顯子1298位點(diǎn)腺嘌呤A被胞嘧啶C替代，表現(xiàn)為3種基因型：AA、AC、CC，使得編碼谷氨酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)楸彼?，使酶的活性降低。MT HFR 677位點(diǎn)胞嘧啶C突變成胸腺嘧啶T，表現(xiàn)為三種基因型：CC、CT、TT，基因突變導(dǎo)致在相應(yīng)位置上MTHFR表達(dá)產(chǎn)物發(fā)生了改變，由纈氨酸代替了丙氨酸，使酶的活性降低。MT RR基因包括14個(gè)內(nèi)含子和15個(gè)外顯子，位于5號(hào)染色體短臂，常見的為A 66 G的多態(tài)性。MT RR 66位點(diǎn)位于第2外顯子，位點(diǎn)腺嘌呤A突變成鳥嘌呤G后，可引起編碼氨基酸由異亮氨酸變?yōu)榈鞍彼?。這3個(gè)基因多態(tài)性位點(diǎn)的基因突變導(dǎo)致葉酸代謝酶活力下降，將導(dǎo)致血漿葉酸和維生素B 12水平降低，血漿同型半胱氨酸水平上升。

馮玲等[14]通過研究葉酸代謝相關(guān)基因的多態(tài)性與唐氏綜合征的發(fā)生關(guān)系發(fā)現(xiàn)，MTHFR C 677 T突變型等位基因(T)頻率，MTRR A 66 G突變型等位基因(G)頻率在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，CC、TT、GG基因型頻率分布差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。MTHFR C 677 T、T 677 T基因型、MTRR G 66 G基因型增加了唐氏綜合征的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)，MT HFR C 677 C基因型可能是降低唐氏綜合征發(fā)生的保護(hù)性因素。Chedraui等[15-16]于2014、2015年2篇研究MTHFR A 1298 C、C 677 T與先兆子癇的發(fā)生關(guān)系的論文指出，發(fā)現(xiàn)攜帶1298 CC純合子突變型和C 677 T多態(tài)性的TT突變基因型的孕婦更容易發(fā)生先兆子癇。劉念等[17]研究認(rèn)為，不良孕產(chǎn)的發(fā)生與其MTHFR基因C 677 T、A 1298 C位點(diǎn)和MTRR基因A 66 G位點(diǎn)的突變純合型基因頻率的增加有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，自然性流產(chǎn)組MTHFR A 1298 C基因型頻率中CC所占比率高于對(duì)照組（P＜0.05）；等位基因頻率中C所占比率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；流產(chǎn)組MTHFR C 677 T等位基因頻率中T所占比率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05）；MTRR A 66 G基因等位基因頻率中G所占比率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），說明MTHFR基因A 1298 C、C 677 T兩個(gè)位點(diǎn)和MTRR A 66 G位點(diǎn)基因的突變基因頻率增加與自然性流產(chǎn)有關(guān)。分析其原因?yàn)槿~酸轉(zhuǎn)運(yùn)和代謝過程中關(guān)鍵的酶MTHFR及MTRR酶位點(diǎn)基因的突變基因頻率增加，導(dǎo)致MTHFR及MTRR酶活性的作用降低，引起血漿高同型半胱氨酸和低葉酸水平，造成同型半胱氨酸在體內(nèi)蓄積，從而導(dǎo)致自然流產(chǎn)和胚胎發(fā)育異常等不良孕產(chǎn)的結(jié)局[18]。

總之，與正常妊娠的婦女比較，反復(fù)自然性流產(chǎn)婦女的MTHFR基因A 1298 C、C 677 T兩個(gè)位點(diǎn)和MTRR A 66 G位點(diǎn)基因的突變基因頻率明顯增加，MTHFR基因和MTRR基因的多態(tài)性的檢測(cè)可作為反復(fù)自然流產(chǎn)患者的臨床診斷指標(biāo)。

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Objective To investigate the susceptibility between a key enzyme in folate metabolism enzyme and recurrent spontaneous abortion. Methods The genetic polymorphisms of MTHFR C 677 T, MTHFR A 1298 C and MT RR A 66 G in 60 cases of recurrent spontaneous abortion and 150 normal pregnant women were detected using gene sequencing technology. Results MTHFR C 677 T T allele frequency in percentage in natural abortion group 30.0% (36/120) was significantly higher than that in the control group 21.3% (64/300) (P ＜0.05); MTHFR A 1298 C CC genotype frequency percentage in natural abortion group 13.3% (8/60) was higher than that in the control group 3.3% (5/150) (P ＜0.05); C allele frequency percentage 35.8% (43/120) was significantly higher than that in the control group 24.7% (74/300) (P ＜0.05); MTRR A 66 G Allelism G gene frequency percentage in natural abortion group 33.3% (40/120) was significantly higher than that in the control group 25.3% (76/300) (P ＜0.05). Conclusion Compared with normal pregnancy women, MTHFR gene A 1298 C, C 677 T and MTRR A 66 G frequency increased in recurrent spontaneous abortion patients, it can be as recurrent spontaneous abortion patients with clinical diagnostic criteria.

Recurrent spontaneous abortion; Methylenetetrahydrofolate reductase; Methionine synthase reductase; Polymorphism; Susceptibility

10.3969/j.issn.1009-4393.2015.33.001

江蘇 215600 張家港市第一人民醫(yī)院 （李曉英 陳麗娟 郭惠萍 強(qiáng)萍）

陳麗娟 E-mail：zhangying 0308@126.com