王豐　范余娟

摘要：以5種長白山有毒真菌為原料，對其活性成分的提取工藝進行初步研究，并對提取液的抑菌作用及其對榆綠毛螢葉甲、蚜蟲的殺蟲活性進行研究。結果表明，提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的抑制效果，對酵母、青霉、米根霉、黑曲霉的抑菌效果不明顯；提取液對榆綠毛螢葉甲、蚜蟲的致死效果從強到弱依次為紅柄牛肝菌>紅菇>毛頭乳菇>鵝膏菌>皂味口蘑。

關鍵詞：長白山；有毒真菌；提取液；生物活性；抑菌效果

中圖分類號： Q939.9 文獻標志碼： A

文章編號：1002-1302（2015）03-0126-04

生物源農(nóng)藥因具有對人、畜安全，不污染環(huán)境，不易引起抗藥性，在自然環(huán)境中易降解等特點，已引起國內外學者高度重視，并成為當今農(nóng)藥研究的熱點[1]。研究發(fā)現(xiàn)，一些大型真菌的子實體從來不被昆蟲侵襲，受傷后的子實體及其發(fā)酵培養(yǎng)物中可以產(chǎn)生具有抗真菌、殺蟲等多種活性的次生代謝產(chǎn)物[2-3]。通過對一些大型有毒真菌的子實體或代謝產(chǎn)物進行抗蟲活性試驗發(fā)現(xiàn)，大型有毒真菌中含有的多種抗蟲活性物質如毒蠅堿、毒肽、毒傘肽等可以直接用于毒殺害蟲，也可以作為生物源農(nóng)藥研究和開發(fā)的材料。目前利用大型真菌提取物在黏蟲、桃潛葉蛾、棉鈴蟲、小菜蛾的拒食和毒殺活性方面的研究已有報道，但是在蚜蟲、榆綠毛螢葉甲方面的研究報道較少，筆者用85%乙醇提取長白山有毒真菌的有效成分，并對其生物活性進行研究，旨在為充分開發(fā)利用該植物資源奠定基礎，并為有毒真菌的高效利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

供試菌種：枯草芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、青霉、米根霉、黑曲霉、酵母（由吉林農(nóng)業(yè)科技學院實驗室提供）；有毒真菌：紅柄牛肝菌、紅菇、毛頭乳菇、皂味口蘑、鵝膏菌（采集于白山市八道江鎮(zhèn)長白山原始林區(qū)）。

試驗儀器：722型紫外可見分光光度計（上海光譜儀器有限公司）、電子恒溫水浴鍋、高溫高壓蒸汽滅菌鍋等。

主要試劑有乙醇、三氯甲烷、丙酮、石油醚、牛肉膏、蛋白胨等，均為分析純。

1.2 試驗方法

1.2.1 真菌提取液的制備 將采集于白山市八道江鎮(zhèn)長白山原始林區(qū)的野生有毒真菌在室溫下避光晾干后粉碎成粗粉，通過單因素試驗和正交試驗（表1、表2），找到超聲輔助乙醇提取的最佳工藝條件[4-5]。

確定最佳條件為A1B2C2D2，即料液比為1 g ∶30 mL、提取時間為30 min、提取溫度為40 ℃、乙醇濃度為85%，在此條件下制備真菌提取液備用。

1.2.2 真菌提取液的抑菌性測定 采用濾紙片法測定真菌提取液的抑菌性：在牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基平板上分別涂布02 mL金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌菌懸液，在PDH培養(yǎng)基平板上分別涂布0.2 mL米根霉、青霉、酵母、黑曲霉懸液；然后將滅過菌的濾紙片浸在提取液中，放入培養(yǎng)皿中，細菌指示菌（金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌）于30 ℃培養(yǎng)，霉菌指示菌（米根霉、青霉、酵母、黑曲霉）于 35 ℃ 培養(yǎng)，做3～4個平行，細菌置于30 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 24 h，霉菌置于35 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后，測量濾紙片抑菌圈直徑大小，抑菌圈越大，表明抑菌效果越好。

1.2.3 真菌提取液對榆綠毛螢葉甲的殺蟲活性測定 榆綠毛螢葉甲的浸漬法（即喂毒和觸殺法）處理：將榆綠毛螢葉甲采集到干燥的塑料瓶中備用，共采樣18份。預先準備18個純凈的塑料瓶，用剪刀將瓶口剪大，剪取18片足夠包裹住瓶口的紗布，并分別在紗布上做記號，另外準備18根皮套及若干棉花團、棉花片備用。每種粗提液做3組對照，將5種粗提液分別倒入5個小燒杯中，分別浸泡榆綠毛螢葉甲5 s，將浸泡后的榆綠毛螢葉甲分別放置在18個純凈的塑料瓶中，在瓶中放入一小團稍微捏干（水不會流出）的濕棉花，且在每個瓶子中放入2張榆樹葉，將棉花片浸濕后稍微捏干放置在瓶口，一半遮蓋一半敞開，然后用紗布包裹住瓶口，再用皮套系牢，防止蟲子從瓶中跑出。以清水作對照，所有步驟處理好后，置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 真菌提取液對蚜蟲的殺蟲活性測定 蚜蟲的浸漬法（即喂毒和觸殺法）處理：采集帶蚜蟲的葉片（帶莖），將大蟲用挑針剔除，在培養(yǎng)皿中裝一半沙子，加水浸濕后將水倒出，在培養(yǎng)皿上蓋1層培養(yǎng)皿口大小的報紙，其上挖1個小洞（每種粗提液做3組，1組培養(yǎng)24 h，另一組培養(yǎng)48 h，共需準備36個這樣的培養(yǎng)皿，分別做好標記），準備好待用。將5種粗提液分別倒入5個小燒杯中，分別浸泡蚜蟲5 s；另以清水作對照。將處理好的帶蚜蟲葉的莖插入到待用培養(yǎng)皿上報紙的小洞中，有蚜蟲的一端朝上。所有步驟處理好后，置于25 ℃的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

2 結果與分析

2.1 有毒真菌提取物對榆綠毛螢葉甲的作用

將按“1.2.3”節(jié)步驟處理的榆綠毛螢葉甲培養(yǎng)24 h后，打開紗布，查看并統(tǒng)計蟲的死亡數(shù)（用鑷子輕輕碰觸，腿會動彈的為活蟲，反之為死蟲），結果見表3。

從表3、表4可以看出，經(jīng)浸漬法處理24、48 h后的榆綠毛螢葉甲在清水中全部存活，而在紅柄牛肝菌溶液中的死亡率最高，紅菇次之，乳菇再次之，且在這3種溶液中的死亡率都達到了70%以上，說明這3種溶液對榆綠毛螢葉甲有強的致死作用，在皂味口蘑和鵝膏菌溶液中的死亡率均為40%左右，說明它們對榆綠毛螢葉甲致死作用相對較弱。

從表5、表6中可以看出，有毒真菌原液稀釋10倍后的致死效果仍是紅柄牛肝菌>紅菇>毛頭乳菇>鵝膏菌>皂味口蘑，但榆綠毛螢葉甲的死亡率降低將近一半，總的來說，還是有致死效果的。

由表7、表8、表9可以看出，有毒真菌原液稀釋20倍的死亡率為0，但將榆綠毛螢葉甲浸泡在稀釋后的粗提液中5 s后，榆綠毛螢葉甲的動態(tài)不同，活潑榆綠毛螢葉甲的數(shù)量排序為清水>皂味口蘑>鵝膏菌>毛頭乳菇>紅菇>紅柄牛肝菌，說明毒性順序依次增強；同時發(fā)現(xiàn)，在清水中的榆綠毛螢葉甲異?；顫姡ㄔ谄孔又猩舷屡佬校?，在紅柄牛肝菌稀釋液中的榆綠毛螢葉甲雖然沒死，但榆綠毛螢葉甲的行動能力明顯減弱，一般聚集在瓶子的底部，只有1～2頭在瓶壁緩慢爬行。

從表10、表11可以看出，經(jīng)浸漬法處理24、48 h后的蚜蟲在清水中全部成活，而在紅柄牛肝菌溶液中的死亡率最高，紅菇次之，乳菇再次之，且在這3種溶液中的死亡率都達到了60%以上，說明這3種溶液對蚜蟲有強的致死作用；在皂味口蘑和鵝膏菌溶液中的死亡率均在33%～42%，說明這2種溶液對其致死作用相對較弱。

從表12、表13中可以看出，有毒真菌原液稀釋10倍后的致死效果從強到弱仍是紅柄牛肝菌>紅菇>毛頭乳菇>鵝膏菌>皂味口蘑，但蚜蟲的死亡率降低將近一半，總的來說，還是有致死效果的。

從上述數(shù)據(jù)可以看出，致死效果為紅柄牛肝菌>紅菇>毛頭乳菇>鵝膏菌>皂味口蘑，將原液稀釋10倍，蚜蟲的死亡率將近降低一半，而將原液稀釋20倍，蚜蟲的死亡率為0，說明在這些菌液中能致死的成分不多。

2.3 抑菌作用

提取液對金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌均有明顯的抑菌效果，對酵母、青霉、米根霉、黑曲霉的抑制效果很弱。用濃縮液對4種霉菌做抑菌性試驗，抑菌效果仍然不明顯。由此可以推斷，鵝膏菌提取液對細菌的抑制活性從強到弱依次為金黃色葡萄球菌>枯草芽孢桿菌>大腸桿菌，對4種霉菌抑制活性不明顯（表17）。

3 結論

本研究表明，有毒真菌提取液對金黃葡萄球菌、大腸桿菌、枯草桿菌均有明顯的抑菌效果，對酵母、青霉、米根霉、黑曲霉的抑菌效果不明顯；提取液對榆綠毛螢葉甲和蚜蟲的致死效果排序為紅柄牛肝菌>紅菇>毛頭乳菇>鵝膏菌>皂味口蘑，將原液稀釋10倍，榆綠毛螢葉甲的死亡率將近降低一半；將原液稀釋20倍，蟲的死亡率為0，說明在這些菌液中能致死的成分不多。

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