張永清 徐春玉 李銳銳 盧靜 焦坤 黃杰 周童亮 苗勁蔚#

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科，北京100026 2首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，北京100069

3美國俄亥俄州立大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，哥倫布200060 4中日友好醫(yī)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室，北京100029

雷帕霉素增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞系對(duì)順鉑敏感性的機(jī)制研究△

張永清1徐春玉1李銳銳1盧靜2焦坤2黃杰3周童亮4苗勁蔚1#

1首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京婦產(chǎn)醫(yī)院婦瘤科，北京1000262首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)室，北京100069

3美國俄亥俄州立大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)室，哥倫布2000604中日友好醫(yī)院基礎(chǔ)實(shí)驗(yàn)室，北京100029

目的研究雷帕霉素對(duì)卵巢癌細(xì)胞系順鉑敏感性的影響，以及PI3K/AKT/m TOR信號(hào)通路（簡稱m TOR信號(hào)通路）與卵巢癌細(xì)胞系順鉑耐藥的相關(guān)性；初探雷帕霉素增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞系順鉑敏感性的分子機(jī)制。方法采用CCK-8法檢測卵巢癌順鉑耐藥細(xì)胞系SKOV3/DDP的耐藥指數(shù)（resistance index，RI）、細(xì)胞增殖抑制率；采用克隆平板實(shí)驗(yàn)觀察不同用藥方案對(duì)卵巢癌順鉑非耐藥細(xì)胞系及SKOV3細(xì)胞系兩種細(xì)胞系克隆形成的影響；采用蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測兩種細(xì)胞系的蛋白表達(dá)差異。結(jié)果①SKOV3/DDP細(xì)胞系的RI為6.10，屬中度耐藥。②在SKOV3細(xì)胞系中，順鉑聯(lián)合雷帕霉素作用24 h、48 h后的細(xì)胞增殖抑制率明顯高于單用順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），兩組間的72 h細(xì)胞增殖抑制率無明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；順鉑聯(lián)合雷帕霉素作用于SKOV3/DDP細(xì)胞系24 h、48 h、72 h后的細(xì)胞增殖抑制率均明顯高于單用順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。③雷帕霉素聯(lián)合順鉑作用于SKOV3細(xì)胞系4 h后，其克隆形成抑制率明顯高于單用順鉑組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。④SKOV3/DDP細(xì)胞系比SKOV3細(xì)胞系p-mTOR、p-AKT的表達(dá)升高，而m TOR、AKT的表達(dá)則相似。⑤聯(lián)合用藥組比單用順鉑組的PARP斷裂增加。⑥雷帕霉素作用SKOV 3細(xì)胞系24 h，BCL2表達(dá)下調(diào)，LC3B由LC3BⅠ向LC3BⅡ轉(zhuǎn)化增加；在SKOV3/DDP細(xì)胞系中未發(fā)現(xiàn)這兩種作用。結(jié)論①在體外培養(yǎng)條件下，雷帕霉素能增強(qiáng)SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞系對(duì)順鉑的敏感性。②m TOR信號(hào)通路激活可能在卵巢癌細(xì)胞系順鉑耐藥機(jī)制中起重要作用。③雷帕霉素增強(qiáng)SKOV3細(xì)胞系對(duì)順鉑敏感性的分子機(jī)制包括：增強(qiáng)順鉑所致的DNA斷裂、下調(diào)抗凋亡蛋白BCL2及引起細(xì)胞自噬；雷帕霉素增強(qiáng)SKOV3/DDP對(duì)順鉑敏感性分子機(jī)制可能與增強(qiáng)順鉑所致的DNA斷裂有關(guān)。

卵巢癌；雷帕霉素；順鉑耐藥；mTOR通路

Oncol prog,2015,13(4)

卵巢癌起病隱匿，確診時(shí)約70%的患者病情已屬晚期，治療效果差[1]。目前，晚期卵巢癌的治療包括腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)及術(shù)后含鉑類藥物聯(lián)合化療，在一定程度上提高了卵巢癌患者的生存率，但其5年平均生存率卻在30%左右[2]。研究表明，約70%的卵巢癌患者對(duì)首次術(shù)后化療有效，但其中大部分患者2年內(nèi)出現(xiàn)復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移[4-5]。鉑類是晚期卵巢癌患者化療的一線藥物，但在治療過程中會(huì)出現(xiàn)耐藥。化療耐藥是晚期卵巢癌治療的難點(diǎn)。

近年發(fā)現(xiàn)m TOR通路在卵巢癌順鉑耐藥機(jī)制中起重要作用[3-4]。作為細(xì)胞生存通路，其在細(xì)胞增殖、生長、生存和代謝中起重要作用。在生長因子的刺激下，PI3K激活并磷酸化PIP2轉(zhuǎn)化成PIP3，PIP3招募下游AKT分子到細(xì)胞膜，使AKT第308位蘇氨酸和第473位絲氨酸磷酸化激活，繼而使多種底物磷酸化而發(fā)揮功能。其中最重要的底物——哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，m TOR）是一種絲/蘇氨酸激酶。AKT直接或通過磷酸化抑制TSC2間接激活mTOR。激活的m TOR與m TOR調(diào)節(jié)相關(guān)蛋白形成復(fù)合物，激活核糖體40S小亞基S6蛋白激酶并磷酸化抑制4E-BP1，引起蛋白轉(zhuǎn)錄增加。該通路異常激活與卵巢癌順鉑耐藥的發(fā)生有關(guān)：透明細(xì)胞癌本身就對(duì)鉑類敏感性差，其p-m TOR的表達(dá)比在漿液性腺癌中的高[5]。小干擾RNA敲除AKT基因，使AKT磷酸化激活減少，能增強(qiáng)順鉑對(duì)SKOV3細(xì)胞增殖的抑制作用[6]。雷帕霉素抑制該通路激活，能增強(qiáng)鉑類對(duì)卵巢癌細(xì)胞系增殖的抑制作用[7]。

本研究選擇人卵巢癌順鉑非耐藥細(xì)胞系SKOV3及順鉑耐藥細(xì)胞系SKOV3/DDP，采用CCK-8法、克隆平板實(shí)驗(yàn)、Western blot等方法檢測雷帕霉素對(duì)兩種細(xì)胞系順鉑敏感性的影響，研究m TOR信號(hào)通路與SKOV3/DDP順鉑耐藥的相關(guān)性，初步探究雷帕霉素抑制卵巢癌細(xì)胞系增殖的分子機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 材料來源

1.1.1 試劑/抗體 順鉑購于齊魯制藥廠；雷帕霉素和單克隆抗體（m TOR、p-m TOR、AKT、p-AKT、PARP、LC3B、BCL2）購于美國CST（Cell Signal Techenology）公司；CCK-8試劑購于碧云天生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 細(xì)胞系和培養(yǎng)條件 SKOV3細(xì)胞系及SKOV3/DDP細(xì)胞系均購于中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院細(xì)胞庫。兩種細(xì)胞系均培養(yǎng)于RPM I 1640、10%胎牛血清和1%雙抗組成的完全培養(yǎng)基中，在37℃、5%CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。SKOV3/ DDP細(xì)胞系采用小劑量順鉑循序誘導(dǎo)耐藥，耐藥穩(wěn)定。為保持SKOV3/DDP細(xì)胞系對(duì)順鉑的耐藥性，實(shí)驗(yàn)前1周用低濃度順鉑（0.5μg/m l）含藥培養(yǎng)基對(duì)其進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 RI測定 取生長良好的SKOV3細(xì)胞系，濃度為每毫升5×104個(gè)，每孔100μl接種至96孔板，培養(yǎng)過夜后，以含有6個(gè)梯度濃度的順鉑培養(yǎng)基替換原培養(yǎng)基（分別為0.3125μg/m l、0.625μg/m l、1.25μg/m l、2.5μg/m l、5μg/m l、10μg/m l），每孔100μl，孵育24 h，每一個(gè)濃度設(shè)4個(gè)平行孔，重復(fù)3次。每孔加入CCK-8試劑10μl，孵育2 h。以450 nm波長測定吸光度（OD值）。SKOV3/DDP的測定方法相同。同時(shí)設(shè)空白組（即含等體積含藥培養(yǎng)基及CCK-8試劑，不含細(xì)胞），測定細(xì)胞增殖抑制率。細(xì)胞增殖抑制率=[1－（ODexp－OD空白）/（ODctrl－OD空白）]×100%（Exp：實(shí)驗(yàn)組，Ctrl：對(duì)照組）。用SPSS 16.0軟件描繪細(xì)胞增殖抑制率與順鉑濃度的關(guān)系方程，求出半數(shù)抑制濃度（IC50）。RI=IC50SKOV3/DDP/IC50SKOV3。

1.2.2 細(xì)胞增殖分析 96孔板中加入生長良好SKOV3細(xì)胞，濃度為每毫升2×104個(gè)，每孔為100μl，隔日棄去培養(yǎng)基。對(duì)照組換用等體積不含藥完全培養(yǎng)基，設(shè)4個(gè)平行孔，重復(fù)3次；實(shí)驗(yàn)組再分為3組，即雷帕霉素20 nmol/L組（RP 20 nM組）、順鉑5μg/m l組（CIS 5μg/m l組）及雷帕霉素20 nM+順鉑5μg/m l組（聯(lián)合用藥或RP 20 nM+CIS 5μg/m l組），每組亦設(shè)4個(gè)平行孔，重復(fù)3次。每組每孔中分別加入對(duì)應(yīng)的含藥培養(yǎng)基各100μl。每組分別設(shè)空白組（含等體積對(duì)應(yīng)含藥培養(yǎng)基及CCK-8試劑，不含細(xì)胞）。采用CCK-8法在24 h、48 h、72 h后測定450 nm波長處的OD值。SKOV3/DDP細(xì)胞系分析方法相同。細(xì)胞增殖抑制率計(jì)算同前。

1.2.3 克隆形成分析 6孔培養(yǎng)板中加入生長良好的SKOV3細(xì)胞，濃度為每毫升100個(gè)，每孔為2m l，隔日棄去培養(yǎng)基。對(duì)照組換用不含藥完全培養(yǎng)基2m l，設(shè)6個(gè)平行孔，重復(fù)3次；實(shí)驗(yàn)組分3組，即RP 20 nM組、CIS 5μg/m l組及RP 20 nM+CIS 5 μg/m l組，每組設(shè)6個(gè)平行孔，重復(fù)3次，每組每孔中分別加入對(duì)應(yīng)的含藥培養(yǎng)基各2m l。實(shí)驗(yàn)組每組按藥物作用時(shí)間不同再分為3組：2 h組、4 h組和24 h組。到達(dá)孵育時(shí)間后，立即更換不含藥完全培養(yǎng)基。14天后，計(jì)數(shù)細(xì)胞克隆（＞50個(gè)考慮在內(nèi)）。克隆形成抑制率=（1－Rexp/Rctrl）×100%（R=細(xì)胞克隆數(shù)）。

1.2.4 Western blot蛋白分析 細(xì)胞培養(yǎng)并離心棄上清，用冰預(yù)冷PBS沖洗兩次，加蛋白裂解液，4℃冰上裂解15分鐘；4℃、12 000 rpm離心機(jī)離心10m in，取上清液分裝，測蛋白濃度。等量蛋白質(zhì)通過SDS-PAGE分離，并轉(zhuǎn)移至聚偏氟乙烯膜。TBST配制5%BSA（牛血清白蛋白），將膜浸入，室溫下封閉1 h。將各種特異性抗體孵育，4℃過夜；封閉液稀釋辣根過氧化酶，標(biāo)記稀釋后的二抗，與膜共同孵育，沖洗。增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光法（enhanced chem ilum inescence，ECL）顯色，曝光。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件。細(xì)胞增殖抑制率、克隆形成抑制率多組比較用方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；采用SPSS擬合細(xì)胞增殖抑制率與順鉑濃度之間的線性方程，計(jì)算IC50；采用Labworks灰度分析軟件分析Western blot圖像。

2 結(jié)果

2.1 RI計(jì)算

如表1所示，順鉑抑制兩種細(xì)胞系的增殖，隨著順鉑濃度的提高，細(xì)胞增殖抑制率亦增加。SPSS擬合兩者的關(guān)系方程：Y1=0.202+0.049X（Y1：SKOV3細(xì)胞增殖抑制率；X：順鉑濃度）；Y2= 0.018+0.013X（Y2：SKOV3/DDP細(xì)胞增殖抑制率）。IC50SKOV3=6.08μg/m l，IC50SKOV3/DDP=37.08μg/m l。SKOV3/ DDP細(xì)胞系RI=IC50SKOV3/DDP/IC50SKOV3=37.08/6.08=6.10。

2.2 不同用藥方案對(duì)兩種細(xì)胞系增殖抑制率的影響

表1 順鉑梯度濃度作用24 h兩種細(xì)胞系增殖抑制率

在SKOV3細(xì)胞系中，聯(lián)合用藥及單用順鉑24 h、48 h、72 h，細(xì)胞增殖抑制率分別為18%± 4%、54%±9%、79%±1%，以及7%±5%、39%±6%、77%±19%）（圖1 A）。其中聯(lián)合用藥組的24 h、48 h細(xì)胞增殖抑制率明顯高于單用順鉑組，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；兩組間的72 h細(xì)胞增殖抑制率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

在SKOV3/DDP細(xì)胞系中，聯(lián)合用藥及單用順鉑24 h、48 h、72 h，細(xì)胞增殖抑制率分別為58%± 7%、77%±3%、79%±4%，以及31%±12%、61%± 23%、64%±3%）（圖1 B）。聯(lián)合用藥組24 h、48 h、72 h細(xì)胞增殖抑制率明顯高于單用順鉑組，其差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖1 不同用藥方案對(duì)SKOV3細(xì)胞系及SKOV3/DDP細(xì)胞系增殖抑制率的影響

2.3 不同用藥方案對(duì)兩種細(xì)胞系克隆形成的影響

在SKOV3細(xì)胞系中，CIS 5μg/m l、RP 20 nM、聯(lián)合用藥作用2 h、4 h及24 h，其克隆形成抑制率分別為8%±2%、3%±5%、100%±0，7%±9%、4%± 6%、5%±8%及10%±8%、89%±6%、100%±0）（圖2 A，圖3 A）。

在SKOV3/DDP細(xì)胞系中，CIS 5μg/m l、RP 20 nM、聯(lián)合用藥作用2 h、4 h及24 h，其克隆形成抑制率分別為87%±4%、97%±1%、100%±0，48%± 15%、62%±19%、39%±19%及75%±12%、100%±0、100%±0）（圖2 B，圖3 B）。

多組間的比較采用方差分析，結(jié)果如下：SKOV3細(xì)胞系，不同方案作用4 h，F(xiàn)=425.89，P＜0.01。多重比較，方差齊，采用LSD檢驗(yàn)：CIS 5 μg/m l組vs聯(lián)合用藥組及RP 20 nM組vs聯(lián)合用藥組，差異均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。SKOV3/DDP細(xì)胞系，不同方案作用2 h，F(xiàn)=19.20，P＜0.01。多重比較，方差不齊，采用Tamhane檢驗(yàn)：CIS 5μg/m l組vs RP 20 nM組，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；RP 20組vs聯(lián)合用藥組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。作用4 h，F(xiàn)=22.76，P＜0.01，差異有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多重比較，方差不齊，采用Tamhane檢驗(yàn)：三組間兩兩比較，差異均有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖2 不同用藥方式對(duì)SKOV3細(xì)胞系及SKOV3/DDP細(xì)胞系克隆形成抑制率的影響

圖3 細(xì)胞克隆平板實(shí)驗(yàn)——培養(yǎng)14天后的結(jié)晶紫染色

2.4 mTOR通路相關(guān)蛋白在兩種細(xì)胞系中的表達(dá)差異

SKOV3細(xì)胞系和SKOV3/DDP細(xì)胞系的pm TOR、p-AKT、m TOR、AKT灰度值分別為0.334、0.402、1.316、1.183，以及0.938、0.912、1.392、1.310（圖4）?；叶确治霰砻鳎琒KOV3/DDP細(xì)胞系比SKOV3細(xì)胞系p-m TOR、p-AKT的表達(dá)升高，而m TOR、AKT的表達(dá)相似。

圖4 m TOR通路相關(guān)蛋白在兩種細(xì)胞系中的表達(dá)差異

2.5 雷帕霉素聯(lián)合順鉑對(duì)兩種細(xì)胞系PARP表達(dá)的影響

SKOV3細(xì)胞系和SKOV3/DDP細(xì)胞系單用順鉑組、單用雷帕霉素組、聯(lián)合用藥組PARP的灰度值分別為0.358、0.142、0.517及0.397、0.240、0.845（圖5）?；叶确治霰砻鳎瑔斡美着撩顾夭灰鹈黠@的PARP斷裂；聯(lián)合用藥組比單用順鉑組使細(xì)胞系PARP斷裂增加。

圖5 不同用藥方案對(duì)PARP表達(dá)的影響

2.6 雷帕霉素對(duì)兩種細(xì)胞系BCL2及LC3B表達(dá)的影響

雷帕霉素作用于SKOV3細(xì)胞系及SKOV3/ DDP細(xì)胞系各24 h，其BCL2、LC3B灰度值分別為0.623、1.101及0.586、0.378，對(duì)照組灰度值分別為1.227、0.451及0.362、0.706（圖6）?；叶确治霰砻鳎赟KOV3細(xì)胞系中，雷帕霉素使BCL2表達(dá)下調(diào)，使LC3B由LC3BⅠ向LC3BⅡ轉(zhuǎn)化增加；而在SKOV3/DDP細(xì)胞系中未發(fā)現(xiàn)這兩種作用。

圖6 雷帕霉素對(duì)兩種細(xì)胞系BCL2和LC3B表達(dá)的影響

3 討論

3.1 雷帕霉素對(duì)癌細(xì)胞系的作用

本研究顯示，SKOV3/DDP細(xì)胞系RI為6.10，屬順鉑中度耐藥，適合進(jìn)行卵巢癌細(xì)胞系順鉑耐藥體外研究。Mazzoletti等[8]在卵巢癌細(xì)胞系及前列腺癌細(xì)胞系中研究發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素可抑制下游AKT蛋白磷酸化。Lu等[9]提出，雷帕霉素可增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞的自噬作用。本研究結(jié)果表明，雷帕霉素能明顯增強(qiáng)順鉑對(duì)SKOV3及SKOV3/DDP細(xì)胞系增殖的抑制作用，與文獻(xiàn)報(bào)道相符合。另外，兩種細(xì)胞系對(duì)雷帕霉素的敏感性也不同。單用RP 20 nM對(duì)SKOV3/DDP細(xì)胞系增殖抑制作用強(qiáng)，可能與SKOV3/DDP細(xì)胞系m TOR通路存在更多激活有關(guān)。

3.2 mTOR通路與卵巢癌細(xì)胞耐藥相關(guān)性

當(dāng)mTOR通路激活時(shí)，AKT和m TOR被磷酸化為p-AKT、p-m TOR。Peng等[10]發(fā)現(xiàn)順鉑可誘導(dǎo)卵巢癌細(xì)胞中PI3K通路的激活，通過抑制AKT或m TOR的表達(dá)來增強(qiáng)耐藥株對(duì)順鉑的敏感性。Wang等[11]發(fā)現(xiàn)m icroRNA-199a通過下調(diào)mTOR的表達(dá)來逆轉(zhuǎn)卵巢癌細(xì)胞對(duì)順鉑的耐藥性。Jeong等[12]發(fā)現(xiàn)PI3K在卵巢癌紫杉醇耐藥細(xì)胞及卵巢癌組織中表達(dá)明顯增高，以siRNA沉默PI3K表達(dá)可通過抑制S期激酶相關(guān)蛋白——Skp2的表達(dá)，阻斷細(xì)胞由G1期向S期過渡，從而增強(qiáng)耐藥細(xì)胞對(duì)紫杉醇的敏感性；另建立裸小鼠耐藥移植瘤模型，進(jìn)一步證實(shí)了沉默PI3K在體內(nèi)的化療增敏作用。本研究數(shù)據(jù)顯示，SKOV3/DDP中p-AKT和pm TOR的表達(dá)明顯高于SKOV3，推測卵巢癌順鉑耐藥可能與m TOR通路激活有關(guān)。

3.3 雷帕霉素增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞系順鉑敏感性可能的分子機(jī)制

鉑類耐藥機(jī)制尚不完全清楚，研究認(rèn)為由多因素導(dǎo)致，包括：鉑類藥物與DNA結(jié)合不充分、細(xì)胞解毒作用增強(qiáng)、DNA修復(fù)增強(qiáng)、運(yùn)載體表達(dá)下調(diào)、腫瘤細(xì)胞染色體改變、癌基因激活及抑癌基因缺失，以及細(xì)胞凋亡途徑相關(guān)基因表達(dá)改變，如p53基因[13]。

順鉑能結(jié)合細(xì)胞DNA，形成鏈間交聯(lián)及鏈內(nèi)二元N7位加合物，引起DNA損傷，從而抑制DNA復(fù)制。大量文獻(xiàn)表明，PARP可作為DNA損傷的感受器，它是細(xì)胞凋亡的標(biāo)志[14]。Peng等[10]報(bào)道，聯(lián)用雷帕霉素及順鉑使卵巢癌順鉑敏感株OV433及耐藥株OV433-CR PARP斷裂增加。Schlosshauer等[7]發(fā)現(xiàn)，雷帕霉素能增強(qiáng)卡鉑引起的DNA斷裂，使PARP表達(dá)增加。本研究結(jié)果顯示，單用雷帕霉素不引起PARP斷裂，聯(lián)合用藥比單用順鉑能明顯增加PARP的斷裂，結(jié)果與文獻(xiàn)描述相吻合。

目前，學(xué)者們已普遍達(dá)成共識(shí)，細(xì)胞對(duì)程序性死亡產(chǎn)生抵抗是導(dǎo)致化療耐藥的一個(gè)主要原因[15]。BCL2蛋白家族通過線粒體膜外抗凋亡成員和促凋亡成員的比例來控制線粒體膜的完整性，決定細(xì)胞的生存與凋亡。細(xì)胞自噬涉及可控自噬小體形成，其與溶酶體融合，自噬小體內(nèi)分子消化，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。本研究顯示：雷帕霉素作用于SKOV3細(xì)胞系24 h后，BCL2比對(duì)照組的表達(dá)降低，LC3BⅠ向LC3BⅡ的轉(zhuǎn)化增加；而作用于SKOV3/DDP細(xì)胞系24 h后，BCL2的表達(dá)比對(duì)照組升高，未發(fā)現(xiàn)LC3BⅠ向LC3BⅡ轉(zhuǎn)化。這表明雷帕霉素抑制SKOV3細(xì)胞系增殖的分子機(jī)制可能與下調(diào)抗凋亡蛋白BCL2的表達(dá)及引起細(xì)胞自噬有關(guān)；在SKOV3/DDP細(xì)胞系中未發(fā)現(xiàn)下調(diào)BCL2及細(xì)胞自噬作用。

本研究首次采用抗凋亡蛋白BCL2及細(xì)胞自噬相關(guān)蛋白LC3B研究雷帕霉素增強(qiáng)卵巢癌細(xì)胞系SKOV3及SKOV3/DDP順鉑敏感性的分子機(jī)制，目前國內(nèi)外尚未見報(bào)道。m TOR信號(hào)通路與卵巢癌順鉑耐藥相關(guān)性及雷帕霉素抑制腫瘤細(xì)胞增殖的研究，為學(xué)者們認(rèn)識(shí)卵巢癌耐藥機(jī)制及臨床應(yīng)對(duì)卵巢癌順鉑耐藥提供了新思路。

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Mechanism of rapamycin increasing the chemosensitivity of ovarian cancer cell lines to cisplatin△

ZHANG Yong-qing1XU Chun-yu1LIRui-rui1LU Jing2JIAO Kun2HUANG Jie3ZHOU Tong-liang4M IAO Jin-wei1#1DepartmentofGynecologicOncology,theBeijingObstetricsandGynecology A ffiliated HospitalofCapitalMedicalUniversity,Beijing100026,China
2Laboratory of PreclinicalMedicine,Schoolof PreclinicalMedicine,CapitalMedicalUniversity,Beijing 100069,China3Laboratory of PreclinicalMedicine,Schoolof PreclinicalMedicine,Ohio State University,Columbia200060,United States4Laboratory of PreclinicalMedicine,Sino-Japanese Friendship Hospital,Beijing 100029,China

ObjectiveThe study is aimed to learn the influence of rapamycin on the sensitivity of cisplatin inovarian cancer cell lines,and to investigate the relationship between them TOR signaling pathway and cisplatin-resistance in ovarian cancer cell lines,besides,themolecularmechanism of the cytotoxic effects of rapamycin on ovarian cancer cell lines is preliminarily explored.MethodThe resistance index(RI)and cell proliferation inhibition rate were analyzed by CCK-8 assay.A fter the adm inistration of different therapies,the influence of colony formation on the two cell lines were evaluated w ith clone tablet experiment.The different expression of proteins in both cell lines were detected using Western blot.Result1)The RIof SKOV3/DDP cell line was 6.10,indicating amoderate resistance to cisplatin.2)In SKOV3 cell line,the cell proliferation inhibition rate of combined therapy groups were significantly higher than that of cisplatin groups after treatment for 24 h and 48 h(P＜0.01),while there was no statistical difference after 72 h treatment(P＞0.05).In SKOV3/DDP cell line,the cell proliferation inhibition rates of combined therapy groupswere significantly higher compared to cisplatin groups in 24 h,48 h,72 h,w ith statistically significant difference(P＜0.01).3)In SKOV3 cell line,when cells were incubated w ith cisplatin+rapamycin for 4h,the colony formation inhibition rate was significantly higher when compared w ith the cisplatin groups(P＜0.01).4)Gray-scale analysis showed that p-mTOR and p-AKT were overexpressed in SKOV3/DDP,while mTOR,AKT had similar expression.5)Rapamycin+cisplatin had more cleavage than cisplatin groups.6)SKOV3 cell line had a decreased expression of BCL2,and an increased transformation from LC3BI to LC3BII when treated w ith rapamycin for 24 hours;And those were not observed in SKOV3/DDP cell line.Conclusion1)In vitro,rapamycin can enhance the chemosensitivity of SKOV3 and SKOV3/DDP cell lines to cisplatin.2)The activation of the m TOR pathway may play an important role in the development of cisplatin-resistance.3)Rapamycin increases the chemosensitivity of SKOV3 cell line to cisplatin,of which the underlying molecularmechanismsmay include:enhancement of cisplatininduced DNA cleavage,downregulation of BCL2 and induce of autophagy,while the mechanisms involved in SKOV3/DDP cell line only include the enhancement of cisplatin-induced DNA cleavage.

ovarian cancer;rapamycin;cisplatin resistance;mTOR pathway

R737.3

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.04.14

北京市留學(xué)人員科技活動(dòng)擇優(yōu)資助項(xiàng)目（20080002）

#通信作者（corresponding author），e-mail：miaojinweigyn@163.com

2014-12-10）