趙引利 何燕寧 楊冬麗 張東閣 楊宇杰 王春民

1.承德醫(yī)學(xué)院中藥研究所中藥實驗中心，河北 承德 067000；2.承德頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司藥物研究院制劑研究中心，河北 承德 067000；3.河北省中藥新輔料工程技術(shù)研究中心藥物制劑研究中心，河北 承德 067000

中藥馬錢子為馬錢科植物馬錢 （Strychnos nux-vom ica）或云南馬錢（Strychnos pierriana）的干燥成熟種子，具有通絡(luò)止痛、散結(jié)消腫等功效[1]。士的寧既是馬錢子的主要有效成分又是有毒成分，占馬錢子總生物堿的50%左右[2]。2010版《中國藥典》所收錄的含馬錢子的中成藥多以片劑、丸劑、膠囊劑等口服用藥為主，且馬錢子在中成藥中均為君藥、臣藥，表明馬錢子治療作用突出[3]。但目前以馬錢子粉或含馬錢子中成藥入藥的藥動學(xué)研究均為大鼠灌胃[4-7]，既難以進(jìn)行臨床用藥劑型研究，又難以實現(xiàn)同一動物多次取血，較難體現(xiàn)藥物在同一個體內(nèi)的藥動學(xué)真實情況，而家兔灌胃含馬錢子中成藥的藥動學(xué)相關(guān)研究尚未見報道。本實驗采用單因素考察，確定含藥血漿處理方法；建立高效液相色譜（HPLC）法測定家兔血漿中士的寧的濃度。以期對含馬錢子中成藥口服類用藥的藥動學(xué)研究提供方法借鑒，以指導(dǎo)臨床安全用藥。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 1260高效液相色譜儀（美國安捷倫公司），G1329B自動進(jìn)樣器，G1314FVWD檢測器；TDL-40B型離心機 （上海安亭科學(xué)儀器廠）；TG16-WS臺式高速離心機（長沙湘儀離心機有限公司）；MX-S可調(diào)式混勻儀（北京大龍興創(chuàng)實驗儀器有限公司）；AL104型電子天平 （上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；AE240型電子天平 （上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；KQ-700DE型數(shù)控超聲清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TDA-8002型水浴鍋（余姚明偉儀表廠）。

1.1.2 藥品與材料 士的寧對照品（中國藥品生物制品檢定所，供含量測定用，按97.1%計；批號：110705-201307）；庚烷磺酸鈉（色譜純，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；批號：20140305）；腰痛寧膠囊（頸復(fù)康藥業(yè)集團(tuán)有限公司；批號：491044）；甲醇、乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純；實驗用水為超純水。實驗用血漿取自新西蘭兔[許可證號：SCXK（京）2014-0003]。

1.2 色譜條件

色譜柱為Agilent 5 TC-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）和 Agilent TC-C18預(yù)柱（12.5 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-0.01 mol/L庚烷磺酸鈉與0.02 mol/L磷酸二氫鉀等量混合（用10%磷酸調(diào)pH至3.0）-乙腈（0.5∶79.5∶20.0）；檢測波長：254 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)儲備液的配制

精密稱取士的寧對照品適量置10 mL棕色容量瓶中，甲醇溶解并定容，配成濃度為0.8292 mg/mL的士的寧儲備液，4℃冷藏備用。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

精密吸取士的寧儲備液適量，用流動相稀釋，得到質(zhì)量濃度為 0.22、0.37、0.75、1.49、4.15、7.46、14.93 μg/mL的士的寧系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，4℃冷藏備用。

分別將 0.37、4.15、14.93 μg/mL 士的寧標(biāo)準(zhǔn)溶液用流動相稀釋5倍，所得溶液，分別標(biāo)記為士的寧標(biāo)準(zhǔn)溶液 a、b、c，4℃冷藏備用。

1.5 血漿樣品處理

1.5.1 堿液種類及濃度考察 精密吸取家兔空白血漿1.5 mL置50 mL尖底離心管中，加入4.15 μg/mL士的寧流動相溶液20 μL，渦旋30 s，配制成一定濃度的含藥血漿；加異丙醇-甲醇（4∶1）混合溶劑0.5 mL，分別考察加入 0.5 mL氨水，0.5 mL的 1、2、3 mol/L NaOH溶液，渦旋30 s，冷水中超聲15 min，加入正己烷-二氯甲烷-異丙醇（60∶35∶5）4 mL，渦旋 1 min，3000 r/min離心10 min，收集下層液，于37℃水浴氮氣吹干，用 100 μL 流動相復(fù)溶，渦旋 1 min，12000 r/min離心15 min，得供試品溶液，進(jìn)樣70 μL測定[8-10]。另取士的寧標(biāo)準(zhǔn)溶液b，直接進(jìn)樣70 μL測定峰面積。將供試品溶液所得士的寧峰面積與對照品流動相溶液的峰面積比較，計算士的寧絕對回收率，結(jié)果分別為32.53%、20.04%、32.41%、32.75%。由結(jié)果可得2 mol/L NaOH溶液與3 mol/L NaOH溶液、氨水的絕對回收率差別不大，但氨水揮發(fā)性強，綜合考慮選擇2 mol/L NaOH溶液。

1.5.2 萃取次數(shù)的考察 考察堿液為2 mol/L NaOH溶液時，萃取次數(shù)分別為1次和2次時士的寧的絕對回收率。萃取1次方法同“1.5.1”項下方法；萃取2次方法同“1.5.1”項下方法，重復(fù)萃取過程2次，合并2次下層液，于37℃水浴氮氣吹干，用100 μL流動相復(fù)溶，渦旋1 min，12000 r/min離心15 min，得供試品溶液，進(jìn)樣70 μL測定。士的寧絕對回收率結(jié)果分別為32.41%和62.34%，表明萃取2次結(jié)果更佳。

1.5.3 萃取劑種類的考察 考察堿液為2 mol/L NaOH溶液，萃取次數(shù)為2次，分別以氯仿、二氯甲烷、氯仿-甲醇（9∶1）、二氯甲烷-甲醇（9∶1）、正己烷-二氯甲烷-異丙醇（60∶35∶5）作萃取劑時士的寧的絕對回收率[10-12]。同“1.5.2”項下方法萃取2次，結(jié)果分別為59.92%、73.54%、53.82%、74.97%、62.34%。根據(jù)結(jié)果可得二氯甲烷和二氯甲烷-甲醇（9∶1）所提士的寧的絕對回收率較為理想，但二氯甲烷萃取后樣品雜質(zhì)較少，同時考慮操作從易的原則，選擇二氯甲烷作為萃取劑。

1.5.4 萃取劑加入量的考察 考察堿液為2 mol/L NaOH溶液，萃取次數(shù)為2次，萃取劑二氯甲烷每次加入量為 3、4、5、6 mL 時士的寧的絕對回收率[13-14]。同“1.5.2”項下方法萃取2次，結(jié)果分別為67.94%、69.30%、79.28%、70.95%。由結(jié)果可得加入量為5 mL時，士的寧的絕對回收率較理想，故選擇每次加入量為5 mL。

繼續(xù)考察萃取劑為二氯甲烷，第1次加入量為5mL，第2次加入量分別為3、4、5 mL時士的寧的絕對回收率。方法同上，結(jié)果分別為69.58%、80.10%、79.28%。由結(jié)果可知，第2次加入量為4 mL和5 mL時結(jié)果均較理想，從節(jié)約資源的角度考慮，選擇第2次加入4 mL。

1.5.5 加萃取劑后渦旋時間考察 考察堿液為2 mol/L NaOH溶液，萃取次數(shù)為2次，萃取劑為二氯甲烷，第1 次 5 mL，第 2 次 4 mL，渦旋時間分別 1、3、5 min 時士的寧的絕對回收率[15]。同“1.5.2”項下方法萃取2次，結(jié)果分別為81.78%、77.77%、77.63%。根據(jù)結(jié)果，渦旋3 min和5 min易產(chǎn)生乳化，使回收率降低，故選擇渦旋1 min。

1.5.6 破膜劑種類考察 考察堿液為2 mol/L NaOH溶液，萃取次數(shù)為2次，二氯甲烷萃取渦旋1 min，第1次5 mL，第 2 次 4 mL，破膜劑分別為異丙醇-甲醇（4∶1）、異丙醇-甲醇（1∶1）和乙腈時士的寧的絕對回收率[8，16]。同“1.5.2”項下方法萃取2次，結(jié)果分別為81.78%、68.03%、85.22%。結(jié)果表明，乙腈做破膜劑較為理想。

1.5.7 血漿樣品處理方法 綜合以上篩選，確定血漿樣品處理方法為：精密吸取含藥血漿1.5 mL置50 mL尖底離心管中，加乙腈和2 mol/L NaOH溶液各0.5 mL，渦旋30 s，置冷水中超聲15 min，再加二氯甲烷5 mL，渦旋1 min，3000 r/min離心10 min，收集下層液；剩余血漿再加二氯甲烷4 mL，渦旋1 min，3000 r/min離心10 min，收集下層液；合并2次下層液，于37℃水浴氮氣吹干，用100 μL流動相復(fù)溶，渦旋1 min，12 000 r/min離心15 min，得供試品溶液，進(jìn)樣70 μL測定。

2 結(jié)果

2.1 方法專屬性

將“家兔空白血漿+士的寧對照”樣品、家兔灌胃腰痛寧膠囊后的含藥血樣、家兔空白血漿，按“1.5.7”項下方法操作，考察方法專屬性。見圖1。

2.2 線性關(guān)系試驗

精密吸取7份家兔空白血漿各1.5 mL，分別加入士的寧對照品系列標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，渦旋30 s，配制成相當(dāng)于士的寧濃度為 2.99、4.98、9.95、19.90、55.28、99.51、199.02 ng/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)樣品，再按“1.5.7”項下方法操作。以士的寧血漿濃度C（ng/mL）為橫坐標(biāo)X，峰面積A為縱坐標(biāo)Y，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線；用加權(quán)（1/C2）最小二乘法進(jìn)行線性回歸運算；以S/N=10測定最低定量限。得線性回歸方程為：Y=1.386 X+1.022，r=0.9985，線性范圍為：2.99～199.02 ng/mL，最低定量限為 0.10 ng。

2.3 回收率試驗

同“2.2”項下方法配制低、中、高 3個濃度（4.98、55.28、199.02 ng/mL）質(zhì)控血漿樣品各 5 份，按“1.5.7”項下方法操作，同時繪制隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，記錄士的寧峰面積AT，計算質(zhì)控血漿樣品中士的寧濃度，用實測濃度平均值與理論濃度比較，求得方法回收率；另取士的寧標(biāo)準(zhǔn)溶液 a、b、c各 5份， 直接進(jìn)樣 70 μL，記錄士的寧峰面積AS，用AT平均值與AS平均值比較，求得絕對回收率，結(jié)果表明士的寧的絕對回收率均＞70%，方法回收率：低濃度在80%～120%，中、高濃度在85%～115%，均符合要求。見表1。

2.4 精密度試驗

精密吸取家兔空白血漿1.5 mL，加入流動相配制的士的寧系列濃度對照品溶液20 μL，渦旋30 s，配制成低、中、高 3 個濃度（4.98、55.28、199.02 ng/mL）的質(zhì)控血漿樣品，每個濃度5份樣品，按“1.5.7”項下方法操作，于1 d內(nèi)每個濃度每份樣品測定1次，同時繪制隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，記錄士的寧峰面積，計算質(zhì)控樣品中士的寧濃度，求得3個濃度的日內(nèi)精密度；連續(xù)測定5 d，每天每個濃度1個樣品，每個樣品測定1次，每天繪制1條隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，記錄士的寧峰面積，計算質(zhì)控樣品中士的寧濃度，求得3個濃度的日間精密度，結(jié)果表明低濃度日內(nèi)、日間精密度均＜20%，中、高濃度均＜15%，結(jié)果均良好。見表2。

2.5 穩(wěn)定性試驗

考察 3 個濃度（4.98、55.28、199.02 ng/mL）質(zhì)控樣品在室溫放置 0、4、8、12、24 h 的穩(wěn)定性；-20℃及室溫凍融循環(huán) 0～3 次的穩(wěn)定性；-20℃保存 0、5、10、15、20 d的穩(wěn)定性。結(jié)果3個濃度樣品峰面積的平均值與0 h或0次測定值的偏差絕對值均在5%以內(nèi)，表明質(zhì)控樣品室溫放置24 h內(nèi)和凍融循環(huán)3次以內(nèi)穩(wěn)定性良好；15 d和20 d樣品中士的寧發(fā)生了分解，0、5、10 d所得數(shù)據(jù)計算偏差絕對值，結(jié)果均在5%以內(nèi)，證明樣品在10 d內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 個濃度（4.98、55.28、199.02 ng/mL）質(zhì)控樣品，按“1.5.7”項下方法操作得到供試品溶液，考察室溫放置0、4、8、12、24 h的穩(wěn)定性。結(jié)果3個濃度質(zhì)控樣品峰面積測定值的平均值與0 h測定值的偏差絕對值均在5%以內(nèi)，表明血樣處理后室溫放置24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

3 討論

圖1 家兔血漿中士的寧的高效液相色譜圖

目前對含馬錢子的中成藥或馬錢子粉的藥動學(xué)研究均為大鼠灌胃[4-7]，難以對同一動物多個時間點取血，因存在個體差異性，無法體現(xiàn)藥物在同一個體內(nèi)藥動學(xué)的真實情況；而家兔灌胃可以實現(xiàn)多點采血，解決了這一問題。故本實驗建立了測定家兔血漿中士的寧的檢測方法。本實驗曾試過Phenomenex C18柱、Kromasil C18柱、Inertsil ODS-3柱等，但有拖尾、峰展寬或分離困難等現(xiàn)象，最終確定為Agilent TC-C18柱，峰分離良好，無拖尾和峰展寬情況，理論塔板數(shù)符合要求[17-18]。在實驗初期，發(fā)現(xiàn)士的寧甲醇溶液進(jìn)液相檢測不成線性，而改為士的寧流動相溶液則成線性，可能是由本實驗流動相的水相比例偏大造成的，故最終選擇用流動相稀釋和樣品定容。樣品處理過程中發(fā)現(xiàn)，加入萃取劑后超聲與否對絕對回收率無影響，說明加堿液已經(jīng)使士的寧游離，可直接萃??；氮氣吹干時水浴溫度為50℃時絕對回收率降低，可能高溫使一些內(nèi)源性物質(zhì)對士的寧產(chǎn)生降解或與之結(jié)合，故最終選擇37℃[19-20]。另外，含藥血漿在-20℃儲存15 d和20 d，發(fā)現(xiàn)峰面積開始減小，且士的寧峰附近出現(xiàn)異常峰，20 d色譜圖最為明顯，士的寧峰與異常峰的峰面積之和與0 d士的寧峰面積接近，懷疑士的寧在血漿內(nèi)源性物質(zhì)的作用下發(fā)生了降解，故血樣-20℃存儲不宜超過10 d。本實驗所得家兔血漿中士的寧的處理方法和檢測方法可靠，有望應(yīng)用到家兔灌胃含馬錢子的中成藥后士的寧的藥動學(xué)研究中。

表1 士的寧的絕對回收率與方法回收率（n=5）

表2 士的寧的日內(nèi)、日間精密度（n=5）

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