范力宏 何 穎 白曉君

1.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院心內(nèi)科，陜西 西安 710061；2.西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院，陜西 西安 710061

吸煙是致動脈粥樣硬化的一個重要危險因素，但其具體致病機(jī)制還不十分清楚，炎性反應(yīng)可能是其中一個重要環(huán)節(jié)。脂肪內(nèi)分泌是近來動脈粥樣硬化研究的熱點[1-3]。筆者之前的研究及其他的相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，吸煙減少脂聯(lián)素的分泌[4-6]。脂聯(lián)素是脂肪組織分泌的一個重要脂肪因子，具有抗感染、抗動脈粥樣硬化作用。而脂肪組織作為一個重要的內(nèi)分泌器官，還分泌著其他大量脂肪因子，這些脂肪因子對炎性反應(yīng)都有潛在的影響。因而，結(jié)合以往的研究，筆者提出吸煙可能對其他脂肪因子也有影響，如果是這樣，脂肪內(nèi)分泌途徑可能是吸煙致動脈粥樣硬化的一條途徑。脂肪素是脂肪分泌的一個重要脂肪因子，同時也是一個重要的炎癥因子，具有促炎、促動脈粥樣硬化作用[1-3]。但關(guān)于吸煙對脂肪素的影響還尚缺乏直接研究。本研究旨在探討吸煙對脂肪素的影響，對比了吸煙人群和非吸煙人群血清脂肪素濃度，并進(jìn)一步通過體外實驗檢測了尼古丁對脂肪細(xì)胞分泌脂肪素的影響以驗證上述問題。

1 資料與方法

1.1 一般資料

2012～2014年連續(xù)入選96名研究對象，為西安西京社區(qū)和水文巷機(jī)關(guān)單位家屬院社區(qū)的男性志愿者，根據(jù)是否吸煙分為吸煙組50例，吸煙指數(shù)為（510±82）（支·年）（吸煙指數(shù)=每天吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù)）；對照組（不吸煙）46例。入選者均已排除糖尿病、心血管疾病、嚴(yán)重肝臟、腎臟疾病及惡性腫瘤。

鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞株由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實驗中心提供。

1.2 儀器與試劑

二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermo，美國）；超凈工作臺（蘇州蘇潔凈化設(shè)備公司，蘇州）；低速離心機(jī)（Eppendorf，德國）；倒置相差顯微鏡（Olympus，日本）；普通冰箱（河南新飛電器有限公司，河南）；超低溫冰箱（Thermo，美國）；壓力滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠，上海）；恒溫水浴箱（北京市醫(yī)療設(shè)備廠，北京）；電熱鼓風(fēng)干燥箱（天津泰斯特儀器有限公司，天津）；酶標(biāo)儀（Bio-Rad，美國）；DMEM/F12 液體培養(yǎng)基（Hyclone公司，美國）；胎牛血清（Gibco公司，美國）；胰酶消化液（Hyclone公司，美國）；脂聯(lián)素酶聯(lián)免疫試劑盒（Phoenix Pharmaceuticals公司）；牛胰島素、地塞米松（DEX）、1-甲基3-異丁基黃嘌呤（IBM）、尼古?。⊿igma公司，美國）。

1.3 方法

1.3.1 入選者受檢前要求維持日常規(guī)律飲食，避免劇烈活動。檢查前12 h禁止飲食，次日測量身高體重，計算體重指數(shù)（BMI）。測量血壓，平臥位，連續(xù)測3次，每次間隔5 min，取3次血壓平均值。采取空腹靜脈血樣，3000 r/min離心分離血漿，一部分用于血脂生化檢測，另一部分冰凍于-70℃下。所有樣本收集后，酶聯(lián)免疫法統(tǒng)一檢測脂肪素濃度。

1.3.2 采用鼠3T3-L1前脂肪細(xì)胞系，誘導(dǎo)分化為成熟脂肪細(xì)胞，方法如筆者前期實驗[6]，以含100 ml/L胎牛血清的DMEM/F12為培養(yǎng)基，于37℃條件下進(jìn)行常規(guī)培養(yǎng)和傳代。前脂肪細(xì)胞生長至完全匯合后2 d進(jìn)行分化誘導(dǎo)，加誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅰ（100 mL/L胎牛血清的 DMEM/F12、牛胰島素 1 mg/L、IBM 0.5 mmol/L、DEX 1.0 μmol/L），2 d 后更換為誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基Ⅱ（100 ml/L胎牛血清的DMEM/F12、牛胰島素1 mg/L），繼續(xù)培養(yǎng)2 d，隨后換為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，隔天換液，繼續(xù)培養(yǎng)4 d。將誘導(dǎo)分化好的成熟脂肪細(xì)胞分為兩組：對照組（PBS組），培養(yǎng)液中加入PBS孵育26 h；尼古丁組，培養(yǎng)液中加入尼古?。?0 μmol/L）孵育 26 h。酶聯(lián)免疫法分別檢測兩組上清液中脂肪素濃度。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 13.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間比較采用t檢驗；以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 臨床研究結(jié)果

吸煙組和對照組比較，年齡、BMI、收縮壓、TG、LDL-C、HDL-C濃度及空腹血糖水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；吸煙組舒張壓、TC濃度明顯高于對照組，而血清脂肪素濃度低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜ 0.05）。見表 1。

2.2 體外細(xì)胞實驗結(jié)果

尼古丁是香煙的主要成分，本研究通過檢測尼古丁對脂肪細(xì)胞分泌脂肪素的影響進(jìn)一步探討了吸煙對脂肪素的影響。實驗結(jié)果表明，脂肪細(xì)胞培養(yǎng)液中加入10 μmol/L的尼古丁后，對照組脂肪素濃度為（17.048±4.580）ng/mL，尼古丁組脂肪素度為（4.555±0.214）ng/mL，尼古丁組上清液的脂肪素濃度明顯低于對照組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 兩組臨床學(xué)指標(biāo)比較（）

表1 兩組臨床學(xué)指標(biāo)比較（）

注：BMI：體重指數(shù)；TC：總膽固醇；TG：三酰甘油；LDL-C：低密度脂蛋白膽固醇；HDL-C：高密度脂蛋白膽固醇；1 mmHg=0.133 kPa

組別 年齡（歲） BMI（kg/m2）收縮壓（mmHg）舒張壓（mmHg）TC（mmol/L）HDL-C（mmol/L）LDL-C（mmol/L）TG（mmol/L）空腹血糖（mmol/L）脂肪素（ng/mL）吸煙組（n=50）對照組（n=46）P值52±11 50±12 0.097 23.05±0.88 24.70±0.71 0.311 116±8 122±6 0.210 88±3 80±4 0.033 5.51±0.60 4.85±0.41 0.013 1.36±0.12 1.44±0.11 0.224 2.13±0.17 1.98±0.23 0.320 1.68±0.34 1.54±0.11 0.087 4.37±0.28 4.33±0.08 0.230 2.434±1.511 4.842±1.768 0.029

3 討論

本研究結(jié)果顯示，吸煙人群的血清脂肪素濃度顯著低于不吸煙的對照組。而且，體外細(xì)胞實驗也發(fā)現(xiàn)尼古丁可使脂肪細(xì)胞分泌脂聯(lián)素顯著減少。這些結(jié)果從不同層次表明吸煙減少脂肪素的分泌。

脂肪組織不僅是一個能量儲存器官，還是一個重要的內(nèi)分泌器官，可分泌一系列蛋白分子，稱為脂肪因子，發(fā)揮著重要的生理和病理作用。其中，脂肪素是脂肪分泌的一個重要的細(xì)胞因子，也是近來研究最多的脂肪因子之一。脂肪素是一個52 kD分子，最早于2005年由Fukuhara等[7]報道。以往的研究發(fā)現(xiàn)，脂肪素是一個重要的炎癥因子并且和動脈粥樣硬化關(guān)系密切[1-3]。近來，更有研究報道血清脂肪素濃度和血管閉塞相關(guān)的梗死及冠狀動脈粥樣硬化性心臟病密切相關(guān)[8]。脂肪素可以促進(jìn)炎性反應(yīng)，引起內(nèi)皮功能障礙，并且和血管的病理改變密切相關(guān)[9-11]。脂肪素可以促進(jìn)一氧化氮合成酶（NOS）競爭性抑制劑不對稱二甲基精氨酸（ADMA）在血清中濃度的升高，從而減少一氧化氮的合成，影響血管內(nèi)皮功能。另一方面，還有研究報道，脂肪素與血流介導(dǎo)的肱動脈舒張減弱有關(guān)，血流介導(dǎo)的肱動脈舒張減弱則反映了動脈硬化早期肱動脈內(nèi)皮功能受損?？偠灾舅睾蛣用}粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)吸煙可以減少脂肪素的分泌，這提示脂肪素可能是吸煙致動脈粥樣硬化的一個重要環(huán)節(jié)。

結(jié)合筆者之前報道的吸煙對另一脂肪因子——脂聯(lián)素的影響[6]，推測吸煙可能對脂肪內(nèi)分泌有著重要影響作用，而脂肪因子對炎性反應(yīng)和動脈粥樣硬化都有著不同程度的作用，這或許是吸煙致動脈粥樣硬化的一條途徑，為研究吸煙致動脈粥樣硬化的機(jī)制提供了新思路。吸煙是否也可影響其他脂肪因子的分泌并通過此途徑促進(jìn)動脈粥樣硬化值得進(jìn)一步研究。這也是接下來要繼續(xù)研究的內(nèi)容。

以往關(guān)于吸煙對脂肪因子分泌影響的直接研究較少。而且主要集中于吸煙對脂聯(lián)素影響的研究。曾有在對糖尿病患者研究時發(fā)現(xiàn)吸煙者的脂肪因子有變化[12-13]。這與本研究的結(jié)果相一致。本研究結(jié)合流行病學(xué)和體外實驗直接證明了吸煙對脂肪素的影響。雖然具體機(jī)制還不清楚，但就以往的相關(guān)研究推測吸煙可能至少通過以下途徑影響脂肪素的分泌：①依賴尼古丁受體途徑：細(xì)胞蛋白激酶C（PKC）、鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMKⅡ）信使途徑[14]。②不依賴于尼古丁受體的途徑：尼古丁進(jìn)入細(xì)胞后可促進(jìn)產(chǎn)生大量超氧陰離子等自由基，超氧陰離子可直接影響細(xì)胞離子通道等表達(dá)和功能，進(jìn)而可能調(diào)控脂肪素的分泌釋放[15]。當(dāng)然，這也是未來要繼續(xù)深入研究的。

本實驗雖然簡單，吸煙組錄入了50例病例，不是大規(guī)模樣本，但本研究入選對象非常嚴(yán)格，均為男性并排除了心血管疾病和糖尿病等，盡可能的排除了調(diào)脂藥、降糖藥等干擾因素。而且，本研究不僅做了臨床流行病學(xué)研究，還進(jìn)一步在體外細(xì)胞實驗中直接檢測了尼古丁對脂肪素分泌的影響，為結(jié)論提供了更多層次的證據(jù)。

綜上所述，本研究通過流行病學(xué)調(diào)查及體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)吸煙減少脂肪素的分泌。這可能是吸煙致動脈粥樣硬化的一條值得研究的潛在途徑。

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