徐東偉 劉同祥

1.中央民族大學(xué)醫(yī)院藥劑科，北京 100081；2.中央民族大學(xué)中國少數(shù)民族傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)研究院藥物化學(xué)所，北京 100081

黃芩素（Baicalein）是黃酮類化合物，唇形科植物主要有效成分之一，具有抗菌、抗氧化，抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤等廣泛的藥理活性，是一種具有很好應(yīng)用前景的藥物，目前臨床上主要用于抗菌消炎及抗感染。但由于其水溶性與脂溶性較差，體內(nèi)生物利用度低，限制了其臨床應(yīng)用[1-3]。

為了有效提高生物利用度，改善其口服吸收，將黃芩素制成脂質(zhì)體，利用磷脂形成的脂質(zhì)雙分子層與生物膜相似，其具有良好的組織相容性和細(xì)胞相容性，囊泡包裹的藥物分子也易被機(jī)體吸收，解決了脂溶性藥物難溶于水的問題。不穩(wěn)定的藥物被脂質(zhì)體包封后受到脂質(zhì)體雙層膜的保護(hù)，提高了易氧化藥物在體內(nèi)外的穩(wěn)定性，具有生物降解性和生物相容性。本課題以脂質(zhì)體作為藥物載體，制備了黃芩素脂質(zhì)體凍干劑，為黃芩素進(jìn)一步拓展新劑型奠定了良好基礎(chǔ)[4-5]。

1 儀器與材料

1.1 儀器

L-2000Elite型高效液相色譜儀（日立高新技術(shù)集團(tuán)）；LGJ-10真空離心濃縮干燥機(jī)（北京松源華興科技發(fā)展有限公司）；Mastersizer2000激光粒度測定儀（英國Malvern公司）；UV-9100型紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）；EM-1400高襯度透射電子顯微鏡（日本電子公司）；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；KQ-250B型超聲波清潔器（昆山市超聲儀器有限公司）；LD4-2A低速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DF-101S恒溫磁力攪拌器（鄭州市亞榮儀器有限公司）。

1.2 材料

透析袋（美國聯(lián)合碳化公司，截留相對分子質(zhì)量8 000～14 000 D；批號：20141108）；大豆卵磷脂（上海太偉藥業(yè)有限公司；批號：20141027）；黃芩素（西安瑞迪生物科技有限公司；純度≥ 98%；批號：20140129）；膽固醇（中國醫(yī)藥集團(tuán)上?；瘜W(xué)試劑公司；批號：20140109）；Sephadex G-50（上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司；批號:20141220）；吐溫80（天津市永晟精細(xì)化工有限公司）；甲醇，乙酸，乙腈為色譜純，其他試劑均為國產(chǎn)分析純或藥用。

2 方法與結(jié)果

2.1 黃芩素脂質(zhì)體的制備

采用乙醇注入法制備黃芩素脂質(zhì)體[6-7]。精密稱取20 mg膽固醇、80 mg卵磷脂、2 mg黃芩素原料藥于小燒杯中，加入5 mL無水乙醇，超聲混勻。在渦旋條件下，將所得混合液用10.0 mL注射器以1 mL/min勻速注入55℃的10 mL磷酸鹽緩沖液（PBS）（pH=7.4，下同）溶液中，超聲1 min后倒入小燒杯，加入轉(zhuǎn)子，磁力攪拌器上慢速攪拌，除去乙醇（溶液體積小于10 mL），再次超聲至體系均勻，得到黃色的帶有淡黃色乳光的混懸液，過0.45 μm微孔濾膜，即得樣品，4℃下保存，備用。空白脂質(zhì)體除不加藥物外，其他條件一樣。

2.2 黃芩素的含量測定方法

精密稱取黃芩素1 mg，置于10 mL量瓶中，用無水乙醇稀釋得0.1 mg/mL儲備液。取該儲備液適量，用無水乙醇稀釋成濃度分別為 1、3、5、7、9、11 μg/mL 的對照品溶液，并在276 nm處測定各溶液的吸光度值（A），以濃度（C，μg/mL）為 X 軸，吸光度（A）為 Y 軸進(jìn)行線性回歸，回歸方程：A=0.1673 C－0.0624（r=0.9994），溶液在 1～11 μg/mL 線性關(guān)系良好。低、中、高濃度（1、5、11 μg/mL）的標(biāo)準(zhǔn)溶液日內(nèi)、日間相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）平均值分別為0.27%和0.55%（n=5）；低、中、高樣品回收率分別為102.08%、99.16%和99.78%（n=3），均符合分析要求。精密吸取300 μL黃芩素脂質(zhì)體至10 mL量瓶中，無水乙醇稀釋至刻度，重復(fù)3次測定吸光度，代入標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，計算得黃芩素脂質(zhì)體的平均含藥量為（0.20±0.03）mg/mL。

2.3 黃芩素脂質(zhì)體的質(zhì)量研究

2.3.1 脂質(zhì)體的形態(tài)及粒徑測定 取脂質(zhì)體混懸液適量，用pH 7.4的PBS適當(dāng)稀釋，經(jīng)激光散射粒度分析儀測定脂質(zhì)體粒徑及分布。結(jié)果表明，黃芩素脂質(zhì)體粒度分布較均勻，平均粒徑為（92.1±9.2）nm，多分散性指數(shù)（PDI）為0.238，粒徑分布見圖1。黃芩素脂質(zhì)體混懸液為帶有淡藍(lán)色乳光的半透明黃色溶液。取脂質(zhì)體混懸液液適量，pH7.4的PBS適當(dāng)稀釋后，用2%磷鎢酸溶液負(fù)染，自然揮干，在透射電鏡下觀察脂質(zhì)體形態(tài)并攝制照片，可見脂質(zhì)體多為球形及類球形粒子，形態(tài)圓整，大小均一，見圖2。

圖1 黃芩素脂質(zhì)體的粒徑分布

圖2 黃芩素脂質(zhì)體的透射電鏡情況

2.3.2 包封率的測定 采用柱層析法測定包封率，取適量充分溶脹的葡聚糖凝膠G-50，制備層析柱（200 mm×15 mm）；精密量取0.5 mL脂質(zhì)體混懸液上柱，流速為0.5 mL/min，室溫操作，以雙蒸水洗脫，收集帶有乳光的洗脫液，置10 mL量瓶中，用無水乙醇定容，渦旋混勻后，按“2.2”項下方法測定脂質(zhì)體中包裹的藥量W1；另取0.5 mL脂質(zhì)體混懸液置10 mL量瓶中，同法操作，測定脂質(zhì)體混懸液中的總藥量W0[8-9]。按下式計算包封率（EE%）：EE%=W1/W0×100%。計算得3批脂質(zhì)體的平均包封率為（82.9±1.4）%，RSD 為 0.82%（n=3）。

2.3.3 穩(wěn)定性參數(shù)的測定 將制備好的黃芩素脂質(zhì)體混懸液，取8 mL置于10 mL的EP管中，3 000 r/min離心20 min后，取下層溶液用無水乙醇適當(dāng)稀釋，以無水乙醇為空白，于276 nm處測定吸光度A0。另取未離心的脂質(zhì)體混懸液同法稀釋后測定A，計算穩(wěn)定系數(shù)K（%）=（A0-A）/A0×100%，K 值越小，則體系的物理穩(wěn)定性越好[10-11]， 反之則越差。結(jié)果重復(fù)3次，K為（0.1188±0.0300），K值較小，說明該法制備的黃芩素脂質(zhì)體混懸液的穩(wěn)定性較好。

2.4 藥物體外釋放研究

按照《中國藥典》2010年版第3法采用透析袋法測定釋放度[12-13]。分別取5 mL黃芩素脂質(zhì)體混懸液（含黃芩素1 mg）和5 mL黃芩素溶液（0.2 mg/mL的乙醇溶液，含黃芩素1 mg）置透析袋中，扎緊兩端，置錐形瓶，釋放介質(zhì)為含0.2%吐溫80的磷酸鹽緩沖液（pH=7.4）， 釋放體積為 100 mL， 轉(zhuǎn)速為 100 r/min，于（37±0.5）℃進(jìn)行試驗。在預(yù)定時間 0、0.5、1、1.5、2、2.5、3、4、6、8、12、24、36 h 取樣 1 mL，同時補(bǔ)充等體積同溫的釋放介質(zhì)。根據(jù)“2.2”項下方法，測量并計算各時間點(diǎn)黃芩素的釋放量，以累積釋放百分率為縱坐標(biāo)，取樣時間為橫坐標(biāo)繪制釋放曲線。5 h內(nèi)黃芩素原料藥已經(jīng)基本釋放完全，而黃芩素脂質(zhì)體釋放不到50%，且釋放速度小于原料藥，36 h累積釋放約80%，具有緩釋效果。見圖3。

圖3 黃芩素脂質(zhì)體和黃芩素原藥的體外釋放曲線

2.5 黃芩素脂質(zhì)體凍干粉的處方優(yōu)化

為了提高黃芩素脂質(zhì)體的穩(wěn)定性，篩選3種不同的凍干保護(hù)劑（甘露醇、葡萄糖和乳糖），在黃芩素脂質(zhì)體混懸液中的濃度分別為3%、5%（W/V），將加有凍干保護(hù)劑的混懸液分裝至西林瓶中，-80℃預(yù)凍12 h，后迅速轉(zhuǎn)移至冷凍干燥機(jī)中冷凍干燥24 h即可。以外觀、色澤、再分散性為主要評價指標(biāo)，評分方法見表1，得分多者較佳，同一得分以輔料用量少者為佳[14]。綜合指標(biāo)分見表2，可見處方2分值最高，即用5%的甘露醇作為凍干保護(hù)劑制備得到的黃芩素凍干粉，外觀飽滿，色澤均一，再分散性好。

表1 凍干粉評分標(biāo)準(zhǔn)

表2 黃芩素凍干粉凍干保護(hù)劑的選擇

3 討論

本研究選擇pH 7.4的磷酸鹽緩沖液作為釋放介質(zhì)，由于黃芩素是水難溶性藥物，具有較強(qiáng)的親脂性，無法滿足體外釋放所需的漏槽條件，所以在釋放介質(zhì)中加入了表面活性劑0.2%吐溫-80，促進(jìn)其在釋放介質(zhì)中的溶解度。在體外釋放過程分為兩個階段，突釋階段和緩釋階段，前者釋放快的原因主要是來自未包封的游離藥物，而以分子或細(xì)小粒子包載在脂質(zhì)體中內(nèi)相的藥物，需要跨越磷脂雙分子層，故而起到了緩釋、長效的作用。

一般采用凝膠層析法測定柚皮素脂質(zhì)體的包封率，但這種方法耗時長并使樣品大量稀釋而不利于藥物含量的測定。柱層析方法由于離心力的作用，加快了脂質(zhì)體和游離藥物的洗脫速度，加之操作簡單并可同時操作多份樣品，大大縮短了測定時間。同時還有對樣品稀釋倍數(shù)小，減少葡聚糖凝膠用量，樣品用量小等優(yōu)點(diǎn)。

本實驗為了降低脂質(zhì)體粒子的粒徑，通過薄膜分散后再經(jīng)過超聲處理，從而減小脂質(zhì)體的粒徑。另外由于其極小的粒徑而具有的黏附性，比表面積大，使其易于黏附于腸壁上，增加了藥物與腸壁的接觸面積和接觸時間，有利于藥物吸收，增加了難溶性藥物的生物利用度[15-20]。

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