黃鸝 劉敬佳 杜立法 曲昂 趙勇 王俊杰# 張建國(guó) 張杰

1北京大學(xué)第三醫(yī)院腫瘤治療中心北京大學(xué)近距離治療中心，北京100191

2中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所生物膜與膜生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京100101 3北京大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科，北京100081

單次、分次照射與125I粒子低劑量率照射對(duì)人喉鱗癌Hep2細(xì)胞的抑制作用

黃鸝1劉敬佳1杜立法1曲昂1趙勇2王俊杰1#張建國(guó)3張杰3

1北京大學(xué)第三醫(yī)院腫瘤治療中心北京大學(xué)近距離治療中心，北京100191

2中國(guó)科學(xué)院動(dòng)物研究所生物膜與膜生物工程國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京1001013北京大學(xué)口腔醫(yī)院口腔頜面外科，北京100081

目的探討125I粒子持續(xù)低劑量率照射與分次照射、單次照射對(duì)人喉鱗癌細(xì)胞Hep2的抑制作用及其作用機(jī)制。方法實(shí)驗(yàn)分為無(wú)照射對(duì)照組（Ctrl組）、單次照射組（SDR組）、分次照射組（FDR組）和125I粒子持續(xù)低劑量率照射組（125I-CLDR組）四組。采用細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)法檢測(cè)Hep2細(xì)胞在不同照射條件下細(xì)胞克隆的形成能力；用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期阻滯情況；用蛋白印跡法檢測(cè)不同照射條件后Hep2細(xì)胞總γ-H2AX、CyclinB1、Caspase3蛋白表達(dá)的變化。結(jié)果經(jīng)2 Gy、4 Gy、6 Gy的劑量照射，125I-CLDR組Hep2細(xì)胞克隆形成率均低于SDR組和FDR組。經(jīng)4 Gy的劑量照射后，125I-CLDR組Hep2細(xì)胞出現(xiàn)G2/M期阻滯，且阻滯效應(yīng)較SDR組及FDR組的細(xì)胞強(qiáng)；125I-CLDR組Hep2細(xì)胞的凋亡比例明顯高于SDR組及FDR組；三個(gè)照射組γ-H2AX、CyclinB1、Caspase3、NF-κB、P21和Cdk1的表達(dá)水平上調(diào)，125I-CLDR組p-Cdc25c蛋白表達(dá)水平低于SDR組和FDR組。結(jié)論在本實(shí)驗(yàn)條件下，125I粒子持續(xù)低劑量率照射較單次照射、分次照射能夠誘發(fā)更多Hep2細(xì)胞出現(xiàn)DNA損傷、引起持續(xù)的G2/M期阻滯、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞的再增殖。

125I粒子；低劑量率照射；Hep2細(xì)胞；DNA損傷；細(xì)胞周期

Oncol Prog，2015，13(1)

放射治療是治療喉鱗癌的標(biāo)準(zhǔn)手段之一[1]。放射治療包括體外照射和體內(nèi)照射，其中體外照射按照射距離又可分為遠(yuǎn)距離照射和近距離照射。近距離照射主要包括組織間照射、腔內(nèi)或管內(nèi)照射、模照射及術(shù)中放置導(dǎo)管的照射，而放射性粒子組織間近距離放療技術(shù)是將放射性同位素直接植入腫瘤內(nèi)，屬于組織間照射。在臨床上，近距離照射治療既可以單獨(dú)用于治療喉鱗癌，也可與遠(yuǎn)距離照射治療相互補(bǔ)充；特別是對(duì)局部復(fù)發(fā)的腫瘤，放射性粒子組織間近距離放療更具優(yōu)勢(shì)[2-6]。放射性粒子組織間近距離放療可在腫瘤局部獲得更高的照射劑量，而對(duì)周圍正常組織的損傷更小，具有更微創(chuàng)和患者更易接受的優(yōu)勢(shì)。本實(shí)驗(yàn)擬從細(xì)胞和分子水平揭示125I粒子持續(xù)低劑量率照射與單次高劑量率照射、分次高劑量率照射對(duì)喉鱗癌Hep2細(xì)胞的抑制作用及相關(guān)機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞培養(yǎng)

人喉鱗癌細(xì)胞Hep2采用含10%胎牛血清的RPM I1640培養(yǎng)基于37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞，經(jīng)胰酶-EDTA消化制成單細(xì)胞懸液，被種植于35mm的培養(yǎng)皿中，細(xì)胞貼壁24 h后進(jìn)行照射。

1.2 實(shí)驗(yàn)分組

實(shí)驗(yàn)分為4組：無(wú)照射對(duì)照組（control group，Ctrl組）、單次高劑量率照射組（high dose rate single dose radiation group，SDR組）、分次高劑量率照射 組（high dose rate fractionated dose radiation group，F(xiàn)DR組）、125I粒子持續(xù)低劑量率照射組（iodine-125 seeds continuous low dose rate radiation group，125I-CLDR組），每組設(shè)置3個(gè)平行樣。

1.3 照射方式

125I-CLDR組采用粒子照射模型[7-8]。模型分上下兩層，均由聚丙乙烯材料制成。下層為粒子板，有6個(gè)照射單元。每個(gè)照射單元的直徑均為34mm，在其圓周上等距離排列了14個(gè)粒子槽，其內(nèi)放置初始活度為92.5MBq（2.5mCi）的125I粒子源（購(gòu)自中國(guó)同輻股份有限公司）。上層為培養(yǎng)板，與粒子板照射單元相對(duì)應(yīng)的位置上放置35 mm的培養(yǎng)皿。照射時(shí)，培養(yǎng)皿及粒子照射模型被放置于鉛盒內(nèi)進(jìn)行防護(hù)。隨后將鉛盒放在培養(yǎng)箱（37℃，5% CO2）內(nèi)，并持續(xù)照射培養(yǎng)。粒子照射的初始劑量率為2.77 cGy/h；照射劑量在2Gy、4Gy、6Gy時(shí)分別需要73.6 h、150.0 h和229.4 h。高劑量率照射時(shí)，使用RS2000 X-ray生物輻射儀（購(gòu)自美國(guó)Rad Source Technologies公司），其劑量率為6312 cGy/h。單次照射組為一次照射完成總劑量；分次照射組每24 h接受照射一次，每次的照射劑量為2Gy。

1.4 檢測(cè)方法

1.4.1 細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn) 取一定數(shù)量的Hep2活細(xì)胞種植于35mm培養(yǎng)皿中，24 h后對(duì)其進(jìn)行照射，完成2 Gy、4 Gy、6 Gy劑量的照射后，繼續(xù)培養(yǎng)。設(shè)開(kāi)始種植細(xì)胞的日期為第1天，至第14天時(shí)，將各組細(xì)胞用甲醇固定10m in，瑞氏-吉姆薩染色液染色5m in，隨后在常規(guī)顯微鏡下計(jì)數(shù)克隆數(shù)。以大于50個(gè)細(xì)胞為1個(gè)克隆，并計(jì)算克隆形成率（plating efficiency，PE）及臨床常用照射劑量2 Gy的存活分?jǐn)?shù)（survival fraction at 2 grey，SF2）。此外，PE的計(jì)算公式為：（克隆數(shù)/細(xì)胞接種數(shù)）×100%；SF2的計(jì)算公式為：（照射組PE/對(duì)照組PE）×100%。

1.4.2 細(xì)胞凋亡的檢測(cè) 照射4 Gy后的第24 h、48 h和72 h，分別消化4組細(xì)胞并均制成濃度為每毫升5×105個(gè)的單細(xì)胞懸液。取1m l的細(xì)胞懸液，用PBS（購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）清洗2遍后，再用200μl染液（其中Annexin V-FITC 5μl，Binding Buffer 195μl；購(gòu)自北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司）避光室溫孵育15m in。用1m l PBS洗1遍，并經(jīng)400μl PBS重懸，加入10μl碘化丙啶（PI，1μg/m l；購(gòu)自美國(guó)Sigma公司）后用流式細(xì)胞儀（型號(hào)為FACScan，購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司）進(jìn)行細(xì)胞凋亡的檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)，Annexin V-FITC陽(yáng)性細(xì)胞為凋亡細(xì)胞。

1.4.3 細(xì)胞周期的檢測(cè) 4 Gy劑量照射后的第24 h、48 h和72 h，分別消化4組細(xì)胞并均制成濃度為每毫升5×105個(gè)的單細(xì)胞懸液。取1m l的細(xì)胞懸液，用預(yù)冷的PBS清洗2遍，預(yù)冷的2m l 75%酒精予以固定，然后置于4℃冰箱過(guò)夜。PBS洗2遍洗去殘余酒精，300μl PBS重懸細(xì)胞，加入PI和RNaseA至終濃度50 ug/m l，37℃水浴避光孵育30 min。隨后用流式細(xì)胞儀（型號(hào)為FACSCalibur，購(gòu)自美國(guó)Becton Dickinson公司）進(jìn)行細(xì)胞周期的檢測(cè)，結(jié)果用ModFitLT 2.0軟件進(jìn)行分析。

1.4.4 相關(guān)蛋白表達(dá)量的檢測(cè) 4 Gy劑量照射后，4組細(xì)胞均于第24 h、48 h和72 h三個(gè)時(shí)間點(diǎn)被分別提取總蛋白。用聚丙烯酰胺凝膠電泳法分離蛋白樣品，電泳后用PVDF膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。5% TBST脫脂牛奶封閉2 h后，加入一抗于4℃下孵育過(guò)夜，TBST液洗滌3遍，再加入二抗于室溫下孵育1 h，TBST液洗滌3遍，最后進(jìn)行顯影。用蛋白印跡法檢測(cè)γ-H2AX、CyclinB1、Caspase3、p-Cdc25c、Cdk1、P21和NF-κB的表達(dá)情況。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

每個(gè)實(shí)驗(yàn)重復(fù)2～3次，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差來(lái)表示。以Graphpad prism 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處理，采用t檢驗(yàn)或雙因素方差分析比較組間差異。以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 不同照射劑量對(duì)四組Hep2細(xì)胞克隆形成的抑制作用

細(xì)胞克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：在2 Gy、4 Gy、6 Gy的照射劑量下，不同的照射方式對(duì)Hep2細(xì)胞克隆形成的抑制能力不同，其中125I-CLDR組的Hep2細(xì)胞克隆形成受到的抑制最強(qiáng)；Ctrl組不接受2 Gy的劑量照射，125I-CLDR組的SF2為0.27，SDR組的SF2為0.34，F(xiàn)DR組為分次照射，每天僅接受一次2 Gy的照射，故其SF2與SDR組的SF2是一致。只有6 Gy的劑量照射后，125I-CLDR組的PE值對(duì)比SDR組的和FDR組的才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，表1）。

表1 四組細(xì)胞在不同照射劑量下的PE（%）

2.2 4Gy照射劑量下四組Hep2細(xì)胞凋亡情況

以4 Gy劑量照射后，與Ctrl組相比，其他三組第24 h、48 h、72 h的細(xì)胞凋亡率均增高；其中125ICLDR組相同照射條件下的細(xì)胞凋亡率顯著高于SDR組和FDR組，組間差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜0.05，表2）。

表2 各組在4Gy的照射劑量下不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)測(cè)得的細(xì)胞凋亡率（%）

2.3 4Gy照射劑量對(duì)Hep2細(xì)胞周期的影響

與Ctrl組相比，4 Gy劑量照射后，其他三組在第24 h、48 h和72 h的G1期細(xì)胞比例均下降，G2/M期細(xì)胞比例均增加；其中125I-CLDR組在各時(shí)間節(jié)點(diǎn)下以G1期細(xì)胞比例下降得最明顯，G2/M期細(xì)胞比例增加得最明顯（圖1）。

2.4 4Gy照射劑量對(duì)相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

在4 Gy的照射劑量下，與Ctrl組相比，以β-Actin為內(nèi)參，其他三組細(xì)胞24 h、48 h、72 h三個(gè)時(shí)間節(jié)點(diǎn)檢測(cè)到的γ-H2AX、Caspase3和CyclinB1蛋白的表達(dá)水平均明顯增加；其中125I-CLDR組γ-H2AX的表達(dá)水平高于FDR組，其CyclinB1的表達(dá)水平也呈現(xiàn)出同樣的趨勢(shì)（圖2）。與Ctrl組相比，以β-Actin為內(nèi)參，其他三組細(xì)胞的NF-κB、P21的表達(dá)水平上調(diào)，F(xiàn)DR組和125I-CLDR組這兩種蛋白的表達(dá)水平均高于SDR組的；125I-CLDR組Cdk1表達(dá)水平上調(diào)最明顯，但其p-Cdc25c的表達(dá)水平低于FDR組和SDR組（圖3）。

3 討論

大部分喉鱗癌患者在臨床診斷時(shí)就處于Ⅲ期或Ⅳ期，治愈率低于30%。晚期喉鱗癌患者需要手術(shù)、放療和化療等綜合治療，盡管這些治療手段有很大的改進(jìn)和提高，但是在過(guò)去30年中，喉鱗癌患者的長(zhǎng)期生存率并沒(méi)有實(shí)質(zhì)性的進(jìn)展，其5年生存率僅為30%～40%[9]。

125I放射性粒子治療喉鱗癌受到中國(guó)學(xué)者的廣泛證實(shí)和驗(yàn)證，大量報(bào)道均明確此方法具有微創(chuàng)、局部劑量高和損傷小的優(yōu)勢(shì)[2-6，10]。單次粒子照射可引起細(xì)胞的DNA損傷，出現(xiàn)細(xì)胞周期的阻滯，從而啟動(dòng)細(xì)胞修復(fù)機(jī)制。如果DNA的損傷能被完全修復(fù)，則可以繼續(xù)細(xì)胞周期進(jìn)程；如果不能被修復(fù)，則可能誘導(dǎo)細(xì)胞的凋亡。有研究顯示，輻射可引起DNA雙鏈斷裂，組蛋白H2AX磷酸化可形成γ-H2AX，其常聚集于DNA雙鏈斷裂的位點(diǎn)或其附近[11]。本研究中，以4 Gy的劑量照射后，Hep2細(xì)胞的γ-H2AX表達(dá)水平明顯上調(diào)，與文獻(xiàn)報(bào)道一致。但是關(guān)于喉鱗癌在持續(xù)低劑量率照射條件下的放射生物學(xué)效應(yīng)鮮有報(bào)道。本研究中，γ-H2AX蛋白的表達(dá)水平在三個(gè)照射組中均較對(duì)照組明顯升高。克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，在2 Gy、4 Gy、6 Gy劑量的照射下，125I-CLDR組Hep2細(xì)胞克隆形成能力的抑制作用最強(qiáng)。克隆形成的實(shí)驗(yàn)為臨床療效的證明提供了基礎(chǔ)，同時(shí)也支持了γ-H2AX表達(dá)的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

Ma等[12]和Yang等[13]在對(duì)125I粒子治療腫瘤所進(jìn)行的研究中發(fā)現(xiàn)，輻射后細(xì)胞的凋亡率明顯增加。在本研究中，125I-CLDR組Hep2細(xì)胞完成4 Gy照射后24 h、48 h、72 h的凋亡率較SDR組、FDR組均有明顯增加，且組間差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與Ctrl組相比，其他三組細(xì)胞中的Caspase3蛋白的表達(dá)水平均明顯增加。Caspase家族在凋亡的調(diào)節(jié)中具有重要作用，且Caspase3是最重要的凋亡執(zhí)行因子之一[14]。本研究中，125I-CLDR組的Caspases3蛋白表達(dá)水平持續(xù)升高，說(shuō)明在125I-CLDR照射下，Hep2細(xì)胞凋亡有持續(xù)增加的趨勢(shì)。

當(dāng)DNA受損時(shí)，細(xì)胞周期的進(jìn)程會(huì)被中斷，修復(fù)蛋白NF-κB等的表達(dá)量會(huì)上調(diào)以便能夠修復(fù)細(xì)胞的損傷。這個(gè)過(guò)程由細(xì)胞周期檢測(cè)點(diǎn)Cyclin/ Cdk復(fù)合物來(lái)調(diào)控。DNA損傷后，通過(guò)p53的穩(wěn)定表達(dá)，上調(diào)p21的轉(zhuǎn)錄，p21結(jié)合并抑制CyclinE/ Cdk2及CyclinD/Cdk4/6。p21是抑制進(jìn)入G1/S期的重要因子。細(xì)胞要進(jìn)入有絲分裂期需要CyclinB1/Cdk1復(fù)合物的活化[15-16]。CyclinB1在G1期表達(dá)水平很低，隨著細(xì)胞的進(jìn)程，CyclinB1表達(dá)逐漸升高，在G2期表達(dá)水平最高，并與Cdk1結(jié)合，形成無(wú)活性的CyclinB1/Cdk1復(fù)合體。在G2/M期，磷酸化的Cdc25c介導(dǎo)CyclinB1/Cdk1復(fù)合體的活化，從而促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入有絲分裂的進(jìn)程[16]。本研究中，經(jīng)過(guò)三組不同方式照射后，Hep2細(xì)胞均出現(xiàn)了G1期細(xì)胞比例下降，G2/M期細(xì)胞比例增加，雖然三個(gè)照射組之間相應(yīng)細(xì)胞周期細(xì)胞比例并沒(méi)有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但是其中以125I-CLDR組的變化最明顯。照射后，125I-CLDR組Hep2細(xì)胞CyclinB1蛋白表達(dá)上調(diào)最明顯，而p-Cdc25c表達(dá)水平最低，說(shuō)明細(xì)胞被持續(xù)阻滯于G2期，很可能是由于125I粒子持續(xù)低劑量率照射抑制了CyclinB1/ Cdk1復(fù)合體的活化。由于細(xì)胞處于G2/M期時(shí)對(duì)照射更敏感，因此，125I粒子持續(xù)低劑量率照射可能更容易引起Hep2細(xì)胞的損傷。

本研究中，125I粒子持續(xù)低劑量率照射可導(dǎo)致Hep2細(xì)胞凋亡率明顯增加，出現(xiàn)持續(xù)的G2/M期阻滯，克隆形成能力明顯下降，說(shuō)明125I粒子持續(xù)低劑量率照射能夠顯著抑制Hep2細(xì)胞增殖。雖然125I粒子持續(xù)低劑量率照射治療喉鱗癌在臨床上是否可行還需被驗(yàn)證，但125I粒子持續(xù)低劑量率照射對(duì)Hep2細(xì)胞的抑制作用對(duì)進(jìn)一步研究有重要的參考價(jià)值。

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The inhibition effectsof different irradiationmethodson human laryngealsquamous carcinoma cell line Hep2

HUANG Li1LIU Jing-jia1DU Li-fa1QU Ang1ZHAO Yong2WANG Jun-jie1#Zhang Jian-guo3Zhang Jie3

1Cancer center,Peking University Third Hospital,Beijing 100191,China
2State Key Laboratory of Biomembraneand Membrane Biotechnology,Instituteof Zoology,Chinese Academy of Sciences,Beijing 100101,China3DepartmentofOraland Maxillofacial Surgery,Peking University Schooland Hospitalof Stomatology,Beijing 100081,China

ObjectiveTo investigate the inhibition effects of different irradiation methods on the proliferation of Hep2,which is the human laryngeal squamous carcinoma cell line,and the corresponding mechanisms.MethodFour groups of patients receiving different irradiations were compared in our experiment,which were non-radiation control group(Ctrl),high dose rate single dose radiation group(SDR),high dose rate fractionated dose radiation group(FDR),and iodine-125 seeds continuous low dose rate radiation group(125I-CLDR),respectively.Colony formation assay was used to determine the radiosensitivity of Hep2 cells to each radiation,and flow cytometry was appliedfor detecting cell apoptosis and cell cycle arrest,while the protein expression levels ofγ-H2AX,CyclinB1 and Caspase3 were detected w ith Western blot.ResultThe capability of clone formation of Hep2 cells after 2 Gy,4 Gy,6 Gy irradiation was lower in125I-CLDR group compare w ith SDR and FDR group.After 4 Gy irradiation,125I-CLDR induced the most significant Hep2 cells arrest effect of G2/M among the three groups.And the highest cell apoptosis proportion was seen in125I-CLDR group either.The expression levels ofγ-H2AX,CyclinB1,Caspase3,NF-κB,P21 and Cdk1 increased among three treatment groups.While p-Cdc25c expressed the least in125I-CLDR group.ConclusionIn the context of this study,125I-CLDR obviously reduces cellular DNA repair capacity,induces cell apoptosis and G2/M arrest,and inhibits cell reproliferation.

125I radioactive seeds;low dose rate radiation;Hep2 cells;DNA damage;cell cycle

R739.65

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.01.14

#通信作者（corresponding author），e-mail：junjiewang_edu@sina.cn

2014-06-27）