劉志英 徐虓 吳英杰

新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院1病理科，2甲乳外科，3醫(yī)務(wù)部質(zhì)管科，烏魯木齊830000

m iRNA-221表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌臨床病理分期的關(guān)系研究△

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新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院1病理科，2甲乳外科，3醫(yī)務(wù)部質(zhì)管科，烏魯木齊830000

目的 探討miRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)及與臨床病理特征的關(guān)系。方法 選取甲狀腺乳頭狀癌（30例）、甲狀腺良性病變（25例）及正常甲狀腺組織（25例）共80例。采用real-time PCR法檢測m iRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌組織、良性病變組織及正常甲狀腺組織樣本中的表達(dá)，并分析m iRNA-221的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的臨床病理特征的相關(guān)性。結(jié)果 m iRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)明顯高于甲狀腺良性病變組織和正常甲狀腺組織（P＜0.05）；miRNA-221的表達(dá)水平與甲狀腺乳頭狀癌組織的病理分級具有明顯的相關(guān)性（r=0.823，P＜0.05）。結(jié)論 m iRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌組織中表達(dá)升高，且與甲狀腺乳頭狀癌的組織病理分級相關(guān)，m iRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展中有重要作用。

miRNA-221；甲狀腺乳頭狀癌；病理

M ircroRNA（m iRNA，m iR）是一種由17～25個堿基組成的單鏈非編碼RNA，廣泛存在于動物、植物體內(nèi)。迄今已經(jīng)在多種物種（包括果蠅、植物、人類等）中鑒別出超過3500種m iRNA分子。隨著對m iRNA的深入研究，發(fā)現(xiàn)m iRNA通過調(diào)控細(xì)胞信號分子來調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、分化和凋亡[3]。miRNA在多種腫瘤中的表達(dá)異常都與腫瘤的發(fā)生發(fā)展、侵襲轉(zhuǎn)移及預(yù)后等密切相關(guān)。

miRNA-221是X染色體的相同基因簇編碼，是由其編碼基因轉(zhuǎn)錄生成的初級轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，在多種腫瘤中表達(dá)異常，如肝癌、甲狀腺癌、白血病和惡性膠質(zhì)瘤等[4]。本研究檢測甲狀腺乳頭狀癌患者的腫瘤組織中m iRNA-221的表達(dá)水平，分析其在甲狀腺乳頭狀癌發(fā)生發(fā)展中的作用，為甲狀腺乳頭狀癌的早期診斷和預(yù)后提供參考。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取自2013年2月至2014年2月就診新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院的甲狀腺乳頭狀癌、甲狀腺良性病變及正常甲狀腺組織共80例。其中甲狀腺乳頭狀癌30例，包括男11例，女19例，年齡22～65歲，平均（43.2±10.8）歲；甲狀腺良性病變25例，其中男8例，女17例，年齡21～60歲，平均（40.2±11.1）歲；因咽喉部腫瘤手術(shù)切除的正常甲狀腺組織25例，其中男11例，女14例，平均（41.8± 10.1）歲。甲狀腺乳頭狀癌的分期按照2002年美國癌癥聯(lián)合會發(fā)布的標(biāo)準(zhǔn)[12]。手術(shù)中取樣本后立即放入液氮中保存，然后轉(zhuǎn)入－70℃冰箱長期保存。

1.2 方法

1.2.1 試劑 RNA提取試劑Trizo（linvitrogen公司）；DNA Marker、PCR試劑盒（晶美生物工程）；hsa-miRNA-221引物（RiboBio公司）；β-actin（Sigma公司）；real-time PCR system（Applied Biosystems公司）、real-time PCR試劑盒（TakaRa公司）。

1.2.2 總RNA的提取 將組織在液氮中磨碎，每50～100mg組織加入Trizol試劑1 m l充分混勻，提取組織中的總RNA。通過異丙醇沉淀濃縮RNA，使用分光光度計(jì)定量，使用1.5%甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳測定RNA質(zhì)量。將提取的RNA保存于－80℃冰箱中備用。

1.2.3 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng) 按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒的說明進(jìn)行操作，RNA的量為0.5μg，冰上加入以下試劑：總RNA 1μl，5×Prime Script Buffer 5 m l，Prime Script RT Enzyme M ix 1μl，stem-loop RT primer 2 μl，并加入DEPC水至總體積為20μl。然后將反應(yīng)管置入PCR反應(yīng)儀中，反應(yīng)條件為42℃反應(yīng)15 m in、85℃反應(yīng)5 s、4℃反應(yīng)15m in，產(chǎn)物在－80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.4 real-time PCR PCR反應(yīng)體系如下：miR-221擴(kuò)增片段長73 bp，其上游引物為5'-CAGCATACATGATTCCTTGTGA-3'，下游引物為5'-CTTTGGTGTTTGAGA TGTTTGG-3'。real-time PCR MasterM ix 10μl，上游引物1μl，下游引物1μl，cDNA 2 μl，加DEPC水至20μl。將反應(yīng)管置于real-time PCR反應(yīng)儀中，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性15min，再按95℃反應(yīng)15 s，60℃反應(yīng)1m in，擴(kuò)增40個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS17.0軟件進(jìn)行分析。m iRNA-221在甲狀腺腫瘤組織及正常組織間的相對表達(dá)水平采用方差分析，采用Spearman等級相關(guān)分析m iRNA-221與臨床病理的相關(guān)性，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 m iRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)

real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)m iRNA-221在30例甲狀腺乳頭狀癌患者中的表達(dá)為（12.26±2.21），在25例甲狀腺良性病變組織中的表達(dá)為（2.16±1.14），在25例正常對照組中的表達(dá)為（1.07±0.83），三者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。m iRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌與良性病變組織中的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；甲狀腺乳頭狀癌與正常對照組織中m iRNA-221的表達(dá)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；良性病變組織與正常組織比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2 m iRNA-221的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌患者臨床病理間的關(guān)系

根據(jù)miRNA-221的表達(dá)差異并結(jié)合患者的臨床病理資料分析得出，m iRNA-221的表達(dá)情況主要與甲狀腺乳頭狀癌的TNM分期有關(guān)，甲狀腺乳頭狀癌分化程度越高，m iRNA-221的表達(dá)也越高，腫瘤的分化程度與m iRNA-221的表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.823，P＜0.05），見表1。

表1 甲狀腺乳頭狀癌分期與m iRNA-221表達(dá)水平的相關(guān)分析

3 討論

甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)病率占全身惡性腫瘤的1%，占甲狀腺結(jié)節(jié)的5%，但卻是內(nèi)分泌系統(tǒng)常見的惡性腫瘤。資料顯示中國近20年來的甲狀腺乳頭狀癌發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，由于其起病多而隱匿，不易發(fā)覺，因而早期診斷困難。近年來，隨著對miRNA與腫瘤關(guān)系研究的深入，目前已有大量的與甲狀腺乳頭狀癌相關(guān)的m iRNA被鑒定[5-6]。Pallante等[7]檢測了m iRNA在甲狀腺乳頭狀癌及正常甲狀腺組織中的表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)m iRNA在二者中的表達(dá)譜明顯不同，乳頭狀癌組織中m iRNA-221、m iRNA-222的表達(dá)明顯高于正常組織。He等[8]通過m iRNA芯片檢測20例甲狀腺乳頭癌組織和6例癌旁正常組織中m iRNA的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miRNA-221、m iRNA-222及miRNA-146在甲狀腺乳頭狀癌中的表達(dá)較正常組織高10～19倍[9]，與本研究的結(jié)果基本一致。本組的研究表明，m iRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌患者中的表達(dá)高于甲狀腺良性病變組織和正常組織，且具有明顯差異；而甲狀腺良性病變組織與正常組織中的m iRNA-221表達(dá)水平無明顯差異。研究提示m iRNA-221可能與甲狀腺乳頭狀癌細(xì)胞的增殖與分化有密切關(guān)系。

Yip等[10]研究通過RT-PCR法檢測出在浸潤性甲狀腺乳頭狀癌中，m iR-221、m iR-146等多種因子的表達(dá)比在非浸潤性甲狀腺乳頭狀癌中的高，與本研究結(jié)果相似。本研究提示甲狀腺乳頭狀癌TNM分期越高，m iRNA-221的表達(dá)與甲狀腺乳頭狀癌的TNM分期呈正相關(guān)。表明m iRNA-221可能在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)展及惡化過程中發(fā)揮重要作用[11]。

綜上所述，m iRNA-221在甲狀腺乳頭狀癌組織中的表達(dá)明顯增加，為甲狀腺癌潛在的特征性分子事件，在甲狀腺乳頭狀癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，檢測m iRNA-221對甲狀腺乳頭狀癌患者的診斷和臨床治療具有一定的指導(dǎo)意義。

［1］李曉靜,蔣玲,婁萍萍,等.甲狀腺癌臨床病理學(xué)特點(diǎn)的回顧性分析[J].中華內(nèi)分泌代謝雜志,2013,29(12): 1010-1014.

［2］史琳,張安文,羅寧,等.細(xì)胞周期正性調(diào)控因子的異常表達(dá)與甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系[J].南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào),2013,33(7):1031-1035.

［3］AgrettiP,Ferrarini E,Rago T,etal.M icroRNA expression profile helps to distinguish benign nodules from papillary thyroid carcinomas starting from cells of fine-needle aspiration[J].Eur JEndocrinol,2012,167(3):393-400.

［4］Dentelli P,Traversa M,Rosso A,etal.m iR-221/222 control luminal breast cancer tumor progression by regulating different targets[J].CellCycle,2014,13(11):1811-1826.

［5］Zhou YL,Liu C,Dai XX,et al.Overexpression ofm iR-221 isassociated w ith aggressive clinicopathologic characteristicsand the BRAFmutation in papillary thyroid carcinomas[J].Med Oncol,2012,29(5):3360-3366.

［6］Yang Z,Yuan Z,Fan Y,et al.Integrated analyses ofm icroRNA andmRNA expression profiles in aggressive papillary thyroid carcinoma[J].Mol Med Rep,2013,8(5): 1353-1358.

［7］Pallante P,Battista S,Pierantoni GM,et al.Deregulation ofm icroRNA expression in thyroid neoplasias[J].NatRev Endocrinol,2014,10(2):88-101.

［8］He XX,Guo AY,Xu CR,et al.Bioinformatics analysis identifies m iR-221 as a core regulator in hepatocellular carcinoma and its silencing suppresses tumor properties [J].OncolRep,2014,2(3):1200-1210.

［9］Yip L,Kelly L,ShuaiY,etal.M icroRNA signature distinguishes the degree of aggressiveness of papillary thyroid carcinoma[J].Ann Surg Oncol,2011,18(7):2035-2041.

［10］Yip Linwah,Lindsey Kelly,Shuai Yongli,etal.M icroRNA signature distinguishes the degree of aggressiveness of papillary thyroid carcinoma[J].Ann Surg Oncol,2011, 18(7):2035-2041.

［11］DentelliP,Traversa M,Rosso A,etal.miR-221/222 control lum inal breast cancer tumor progression by regulating different targets[J].Cell Cycle,2014,13(11):1811-1826.

Theexpression ofm iR-221 in thyroid cancerand its relationshipw ith clincopathologicalstaging△

LIU Zhi-ying1XU Xiao2WU Ying-jie3#
1Departmentof Pathology,2Departmentof Thyroid and BreastSurgery,3MedicalDepartmentof Quality Control,the Fifth A ffiliated Hospitalof Xinjiang MedicalUniversity,Urumqi830000,Xinjiang,China

Objective To explore the m iRNA-221 expression in thyroid neoplasms and its clinical pathological features.Method A total of 80 cases of thyroid papillary carcinoma(30 cases),thyroid benign lesions(25 cases) and normal thyroid(25 cases)were included in this study.Real-time PCR was applied in detecting miRNA-221 expression in thyroid papillary carcinoma,benign lesions and normal thyroid tissue samples,besides,the correlation between m iRNA-221 expression and clinical pathological features of thyroid papillary carcinoma was analyzed.Result The real-time PCR showed that them iRNA-221 expression in thyroid papillary carcinoma tissue is significantly higher than that in either benign lesions or normal thyroid tissue(P＜0.05),and the expression levelwas significantly associated w ith pathological staging of thyroid papillary carcinoma(r=0.823,P＜0.05).Conclusion Them iRNA-221 expression is increased in thyroid papillary carcinoma tissues,and is correlated w ith the pathological staging of thyroid papillary carcinoma tissue,suggesting that the miRNA-221 is significantly engaged in the occurrence and development of thyroid papillary carcinoma.

m iRNA-221;thyroid papillary carcinoma;pathology

R736.1

A

10.11877/j.issn.1672-1535.2015.13.05.17

Oncol Prog,2015,13(5)

甲狀腺癌是頭頸部最常見的腫瘤，也是常見 的內(nèi)分泌惡性腫瘤之一，約占全身惡性腫瘤的1%。其發(fā)病率近年來有逐漸升高的趨勢，特別是在2003年以后，每年以14.51%的速度增長，且發(fā)病年齡趨向年輕化。甲狀腺癌按病理類型可分為：乳頭狀癌和濾泡狀腺癌，其中乳頭狀癌占甲狀腺癌的60%～70%。目前，甲狀腺乳頭狀癌已經(jīng)成為近20年來中國女性惡性腫瘤中發(fā)病率升高迅速的腫瘤之一[1]。甲狀腺乳頭狀癌早期臨床表現(xiàn)不明顯，發(fā)病機(jī)制也不明確，其診斷及預(yù)后缺乏特異性的生物學(xué)指標(biāo)，因此，引起了廣大學(xué)者的深入研究[2]。

新疆醫(yī)科大學(xué)第五附屬醫(yī)院院級科研基金（WFY 2014013）；新疆醫(yī)科大學(xué)科研創(chuàng)新基金（校級，XJC201079）#

（corresponding author），e-mail：wyj9619@126.com

2015-04-29）