鄭磊，樊海平，吳斌，曾占?jí)眩娙?，張新艷

(福建省淡水水產(chǎn)研究所，福建福州 350002)

0 引言

隨著羅非魚養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，羅非魚鏈球菌病日趨嚴(yán)重，其發(fā)病面積之廣、危害程度之重已成為羅非魚養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的主要障礙，并造成重大的經(jīng)濟(jì)損失［1］.農(nóng)業(yè)部2008年新修訂的《一、二、三類動(dòng)物疫病病種名錄》，魚類鏈球菌病被列為三類動(dòng)物疫病，其主要的病原菌是無乳鏈球菌(Streptococcus agalactiae)和海豚鏈球菌(Streptococcus iniae).羅非魚鏈球菌病的病魚主要癥狀為:體色發(fā)黑，臨死前于水面打轉(zhuǎn)或間隙性竄游，部分病魚眼球突出或混濁發(fā)白，腹部體表具點(diǎn)狀或斑塊出血或潰瘍，鰓蓋內(nèi)側(cè)出血，肝臟、膽囊、脾臟腫大，嚴(yán)重時(shí)糜爛，腸道和胃積水或積黃色粘液.此病危害各種大小的魚，100 g以上規(guī)格容易感染，傳染性強(qiáng)，發(fā)病率達(dá)10%～30%，死亡率達(dá)25% ～80%，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失.目前，國內(nèi)羅非魚鏈球菌病害防控沒有特效的藥物，因此，建立羅非魚無乳鏈球菌快速檢測(cè)體系對(duì)羅非魚養(yǎng)殖的健康發(fā)展能夠起到積極作用.無乳鏈球菌鏈球的多重PCR及real－time PCR鑒定已有報(bào)道［2－4］，但其檢測(cè)方法耗時(shí)、設(shè)備要求高.環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(loop－mediated isothermal amplification，LAMP)是一種新穎的核酸擴(kuò)增方法，具有特異性高、操作簡(jiǎn)單、肉眼判斷結(jié)果的特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于病原微生物及寄生蟲的檢測(cè)［5－8］.其中，王永等［9］和Kimura等［10］分別針對(duì)牛源的無乳鏈球菌FBS基因及人源的無乳鏈球菌CFB基因設(shè)計(jì)LAMP檢測(cè)引物組，建立了LAMP檢測(cè)方法.

無乳鏈球菌的血清學(xué)分類是依據(jù)其菌株的莢膜多糖的特異性，目前已經(jīng)鑒定出10種不同的莢膜類型(Ia、Ib、II、III、IV、V、VI、VII、VII和 IX).其中 Ia、Ib和 III型為目前確定的水生動(dòng)物源血清型［11－12］.Brodeur等［13］的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明無乳鏈球菌表面免疫相關(guān)蛋白(surface immunogenic protein，SIP)廣泛存在于多種血清型(Ia、Ib、II、III、V和VI)中，表明SIP基因存在于水生動(dòng)物源的三種血清型.此外，SIP基因序列(登錄號(hào):FJ752159.1)Blast結(jié)果顯示其與數(shù)據(jù)庫中其它登陸SIP基因序列相似性為97%～100%，表明SIP具有高度的序列保守性，可成為羅非魚無乳鏈球菌檢測(cè)的重要候選基因.

本研究首次針對(duì)羅非魚無乳鏈球菌SIP基因設(shè)計(jì)了LAMP檢測(cè)引物組，對(duì)無乳鏈球菌病進(jìn)行檢測(cè)，優(yōu)化反應(yīng)條件，驗(yàn)證了方法的特異性和靈敏度，并應(yīng)用該方法檢測(cè)人工攻毒樣品.

1 材料與方法

1.1 菌株

包括2株羅非魚無乳鏈球菌株，8株其它鏈球菌屬菌株及6株水體常見菌株，詳見表1.

表1 實(shí)驗(yàn)菌株Tab.1 Bacterial strains

1.2 試劑

細(xì)菌DNA提取試劑盒及SYBR Green I購自廈門泰京生物技術(shù)公司;BstDNA聚合酶購自New England Biolabs公司;甜菜堿(Betain)購自Sigma公司;dNTPs、MgCl2、DL2000 DNA Marker和Premix Ex Taq購自TaKaRa公司;細(xì)菌培養(yǎng)基購自北京陸橋公司.

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 細(xì)菌DNA提取

無乳鏈球菌(ScTnB0902L)接種腦心浸液培養(yǎng)基(BHI)，28℃過夜培養(yǎng)，采用細(xì)菌DNA提取試劑盒提取DNA，－20℃保存?zhèn)溆?

1.3.2 引物設(shè)計(jì)

根據(jù)GenBank公布的無乳鏈球菌SIP基因序列(登錄號(hào):FJ752159.1)，用Primer Explorer IV軟件分析設(shè)計(jì)一套引物(F3、B3、FIP、BIP)，分別是前外引物F3，后外引物B3，前內(nèi)引物FIP，后內(nèi)引物BIP，見表2.

表2 LAMP引物Tab.2 Specific primer sequences for LAMP

1.3.3 LAMP 方法的建立

LAMP反應(yīng)體系為25 μL.優(yōu)化后的反應(yīng)組分見表3.反應(yīng)條件:混勻后將反應(yīng)液放入恒溫水浴鍋，61℃反應(yīng)60 min.反應(yīng)產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)或直接加入2 μL熒光顯色劑SYBR Green I(稀釋100倍)，觀察顏色變化.

表3 LAMP反應(yīng)體系組成Tab.3 Reaction composition of LAMP

1.3.4 LAMP 特異性

提取8株鏈球菌屬和6株水體常見病原菌的DNA，采用1.3.3建立的LAMP反應(yīng)體系檢測(cè)，反應(yīng)產(chǎn)物采用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè).

1.3.5 LAMP方法檢測(cè)無乳鏈球菌的靈敏度

無乳鏈球菌(ScTnB0902L)接種腦心浸液固體培養(yǎng)基(BHI)純培養(yǎng)后，用滅菌的生理鹽水洗脫，洗脫液進(jìn)行10倍比稀釋，各取每個(gè)稀釋度的菌液1 mL，用試劑盒提取DNA后進(jìn)行LAMP擴(kuò)增.

1.3.6 LAMP 檢測(cè)方法的應(yīng)用

無乳鏈球菌(ScTnB0902L)接種腦心浸液固體培養(yǎng)基(BHI)純培養(yǎng)后，用滅菌的生理鹽水洗脫.羅非魚每尾腹腔注射0.2 mL菌液，菌濃度為2.6×106CFU·mL－1，共注射11尾.24 h后，取其肝、腎和脾，用試劑盒提取DNA后進(jìn)行LAMP擴(kuò)增，同時(shí)采用福建省地方標(biāo)準(zhǔn)DB35/T 1354－2013《羅非魚無乳鏈球菌病雙重PCR診斷規(guī)程》鑒定.

2 結(jié)果與討論

2.1 LAMP 擴(kuò)增結(jié)果

采用1.3.3所述方法，無乳鏈球菌LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果見圖1，可以觀察到LAMP反應(yīng)的特異性梯狀條帶.圖2為對(duì)應(yīng)的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物熒光顯色結(jié)果，陰性組保持橙色不變，而加入無乳鏈球菌DNA的反應(yīng)組顏色變?yōu)榫G色，表明優(yōu)化的LAMP反應(yīng)體系可以有效地?cái)U(kuò)增無乳鏈球菌DNA.

2.2 LAMP方法檢測(cè)無乳鏈球菌的特異性

采用1.3.4所述方法，特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，以兩株無乳鏈球菌DNA為模板擴(kuò)增出特異性梯狀條帶，而8株鏈球菌屬菌株及6株水體常見菌株均未擴(kuò)增出相應(yīng)產(chǎn)物(見圖3(a)).圖3(b)分別為對(duì)應(yīng)的LAMP擴(kuò)增產(chǎn)物熒光顯色結(jié)果，2株無乳鏈球菌的反應(yīng)組顏色變?yōu)榫G色，其它14株非無乳鏈球菌保持橙色未變.測(cè)試結(jié)果表明針對(duì)無乳鏈球菌SIP基因?yàn)槟０宓腖AMP檢測(cè)方法具有良好的特異性.

圖1 無乳鏈球菌LAMP產(chǎn)物電泳檢測(cè)結(jié)果Fig.1 Electrophoresis of LAMP products of Streptococcus agalactiae

圖2 無乳鏈球菌LAMP產(chǎn)物熒光染色結(jié)果Fig.2 The LAMP products of Streptococcus agalactiae after adding fluorescent dye

圖3 LAMP檢測(cè)無乳鏈球菌特異性結(jié)果Fig.3 Specificity of LAMP primers detection Streptococcus agalactiae

2.3 LAMP方法檢測(cè)無乳鏈球菌的靈敏度

經(jīng)平板計(jì)數(shù)，原始無乳鏈球菌菌液濃度為3.0×108CFU·mL－1.10 倍倍比稀釋菌液并提取DNA進(jìn)行LAMP檢測(cè).電泳檢測(cè)結(jié)果顯示，當(dāng)菌液稀釋到3.0×101CFU·mL－1時(shí)仍可見梯狀擴(kuò)增產(chǎn)物(見圖4)，表明LAMP法檢測(cè)靈敏度達(dá)30 CFU·mL－1.

2.4 LAMP檢測(cè)方法的應(yīng)用

應(yīng)用LAMP方法，對(duì)人工感染的11尾羅非魚的肝、腎和脾進(jìn)行檢測(cè).結(jié)果表明，LAMP方法檢測(cè)11尾魚全部呈陽性，檢測(cè)結(jié)果與福建省地方標(biāo)準(zhǔn)DB35/T 1354—2013《羅非魚無乳鏈球菌病雙重PCR診斷規(guī)程》一致.

圖4 無乳鏈球菌LAMP檢測(cè)靈敏度的電泳圖Fig.4 Sensitivity of LAMP products for Streptococcus agalactiae

3 結(jié)論

相比于PCR檢測(cè)方法，LAMP反應(yīng)過程無需高精密度的溫度循環(huán)裝置，對(duì)設(shè)備要求低，操作簡(jiǎn)單，檢測(cè)成本低，產(chǎn)物可通過離心觀察是否有沉淀，或加入熒光顯色劑觀察是否變色來判斷檢測(cè)結(jié)果，適用于基層水產(chǎn)科研機(jī)構(gòu)、各類水產(chǎn)養(yǎng)殖場(chǎng)的使用，具有實(shí)踐應(yīng)用價(jià)值.

研究結(jié)果顯示，建立的LAMP檢測(cè)方法特異性好，檢測(cè)靈敏度高達(dá)30 CFU·mL－1，1 h即可完成擴(kuò)增，為羅非魚無乳鏈球菌病的快速診斷提供一種重要的技術(shù)手段，對(duì)于羅非魚無乳鏈球菌病的早期診斷具有重要意義.

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