盧巧梅， 張文敏， 黃川輝， 盧明華， 勵(lì)建榮， 張 蘭

(1. 福州大學(xué)測(cè)試中心， 福建 福州 350002； 2. 福州大學(xué)食品安全與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350116； 3. 浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院, 浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 杭州 310035； 4. 渤海大學(xué)遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 錦州 121013)

懸浮固化液相微萃取-高效液相色譜法分析生長(zhǎng)素

盧巧梅1, 2， 張文敏2， 黃川輝2， 盧明華2， 勵(lì)建榮3, 4， 張 蘭1, 2

(1. 福州大學(xué)測(cè)試中心， 福建 福州 350002； 2. 福州大學(xué)食品安全與檢測(cè)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 福建 福州 350116； 3. 浙江工商大學(xué)食品與生物工程學(xué)院, 浙江省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 浙江 杭州 310035； 4. 渤海大學(xué)遼寧省食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 遼寧 錦州 121013)

建立基于懸浮固化液相微萃取預(yù)處理的高效液相色譜-熒光檢測(cè)法(SFODME-HPLC-FLD)用于兩種植物生長(zhǎng)素(吲哚丙酸和吲哚丁酸)的分析. 實(shí)驗(yàn)考察各因素對(duì)萃取過(guò)程的影響， 確定最佳條件： 50 μL十二醇(純)為萃取劑， 20.0 mL樣品溶液(pH 3.0)、 0.25 g·mL-1NaCl、 26 ℃、 1 800 r·min-1條件下萃取10 min. 結(jié)果表明， SFODME技術(shù)重現(xiàn)性好、 靈敏度高， 相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差小于8.66%， 檢測(cè)限為0.01 ng·mL-1， 線性范圍為0.02～60 ng·mL-1， 加標(biāo)回收率大于84.3%. 方法快速、 穩(wěn)定、 環(huán)境友好， 適用于實(shí)際樣品的檢測(cè).

懸浮固化液相微萃??； 高效液相色譜； 液相微萃?。?生長(zhǎng)素

0 引言

樣品前處理一直是分析檢測(cè)的難點(diǎn). 自1996年Jeannot和Cantwell提出液相微萃取(LPME)方法[1]后， 為了拓展LPME實(shí)用性， 學(xué)術(shù)界提出了多種模式， 包括單滴液相微萃取(SDME)[2]、 中空纖維-液相微萃取(HF-LPME)[3]、 分散液液微萃取(DLLME)[4]、 懸浮固化液相微萃取(SFODME)[5]等. 上述方法中， SDME將有機(jī)液滴懸掛在微量進(jìn)樣器針頭上， 液滴表面積小、 易脫落而影響萃取效果和穩(wěn)定性； HF-LPME以中空纖維為載體， 增大了萃取表面積， 富集效果有所提高； DLLME技術(shù)將分散劑和萃取劑混合， 萃取在數(shù)分鐘內(nèi)完成， 極大縮短了前處理時(shí)間， 但此方法中萃取劑和基質(zhì)共沉淀于試管底部， 基質(zhì)干擾很難避免； SFODME技術(shù)相對(duì)于以上預(yù)處理方法， 采用密度小于水的低毒萃取劑， 萃取完成后使上浮的萃取劑固化取出， 室溫融化后進(jìn)樣測(cè)定[6]， 所以能簡(jiǎn)單地實(shí)現(xiàn)目標(biāo)物與基質(zhì)分離， 特別適合于復(fù)雜樣品的處理. 當(dāng)前， 已開(kāi)展了該方法在環(huán)境污染物[7-9]、 離子檢測(cè)[10-11]等方面的應(yīng)用研究.

吲哚丙酸(indole propionic acid, IPA)和吲哚丁酸(indole butyric acid, IBA)是常見(jiàn)的外源性植物生長(zhǎng)素， 廣泛應(yīng)用于植物組織培養(yǎng)、 扦插技術(shù)中. 這類(lèi)物質(zhì)的廣泛使用將導(dǎo)致在水源、 果蔬表面甚至食品中殘留激素[12-14]， 對(duì)環(huán)境和食品安全存在隱患和危害. 研究應(yīng)用SFODME技術(shù)結(jié)合高效液相色譜-熒光檢測(cè)法(HPLC-FLD)測(cè)定上述2種生長(zhǎng)素， 既獲得高效前處理的結(jié)果， 還提高了方法的選擇性及靈敏度.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器和試劑

Agilent 1100系列液相色譜儀， 配有熒光檢測(cè)器(Agilent公司， 美國(guó))； Milli Q超純水器(Millipore公司, 美國(guó))； DF-101S恒溫加熱磁力攪拌器(予華儀器有限責(zé)任公司).

標(biāo)準(zhǔn)品IPA和IBA(純度均> 98%)購(gòu)自百靈威化學(xué)試劑公司； 十一醇和十二醇分別購(gòu)于上海晶純?cè)噭┯邢薰竞虯lfa Aesar公司； 甲醇為色譜純， 其余試劑均為分析純. 所有溶液使用前均用0.45 μm濾膜過(guò)濾.

1.2 液相色譜

甲醇 ∶水(65 ∶35， 體積比)為流動(dòng)相， Zorbax 300 SB C8(5 μm × 4.6 mm × 150 mm， Agilent)色譜柱， 流速0.8 mL·min-1， 柱溫30 ℃， FLD檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm/360 nm(激發(fā)波長(zhǎng)/發(fā)射波長(zhǎng))， 進(jìn)樣量10 μL.

1.3 溶液配制和樣品處理

標(biāo)準(zhǔn)溶液配制： 稱(chēng)取IPA和IBA標(biāo)準(zhǔn)品用甲醇配制成2.000 mg·mL-1儲(chǔ)備液， 4 ℃貯存， 臨用前逐級(jí)用甲醇稀釋.

實(shí)際樣品： 植物培養(yǎng)基干粉購(gòu)自杭州臨安木木生物技術(shù)有限公司. 稱(chēng)取3 g干粉用100 mL二次水加熱攪拌溶解、 稀釋?zhuān)?備用.

1.4 SFODME法

準(zhǔn)確吸取20.0 mL樣品溶液(pH=3.0， 0.25 g·mL-1NaCl)于25 mL萃取瓶中， 以50.0 μL十二醇為萃取劑， 1 800 r·min-1、 26 ℃攪拌10 min. 取出樣品瓶， 冰浴5 min后用藥匙取出上浮的十二醇固體， 室溫融化后分析.

2 結(jié)果與討論

2.1 SFODME影響因素2.1.1 萃取劑種類(lèi)

萃取劑的選擇能夠顯著影響萃取效果. SFODME技術(shù)要求萃取劑的密度小于水、 熔點(diǎn)接近室溫、 揮發(fā)性弱. 選擇了符合上述條件的兩種溶劑： 純十一醇(熔點(diǎn)： 13～15 ℃)， 純十二醇(熔點(diǎn)： 22～24 ℃)， 結(jié)果表明， 純十二醇萃取效果更為理想.

2.1.2 萃取溫度、 萃取劑體積、 離子強(qiáng)度、 pH值、 攪拌速度

在SFODME中， 萃取溫度升高， 有利于縮短平衡時(shí)間. 萃取劑體積增大， 直接增大目標(biāo)物的萃取量， 但由此引起的稀釋效應(yīng)將影響方法的靈敏度. 樣品溶液中離子強(qiáng)度增加， 使得分析物和萃取劑在水中的溶解度減小， 有利于萃取和富集. 通過(guò)調(diào)節(jié)溶液pH， 使2種生長(zhǎng)素最大程度的以分子形式存在， 從而提高色譜的信號(hào)響應(yīng). 選擇合適的攪拌速率， 能實(shí)現(xiàn)萃取劑和樣品溶液中目標(biāo)物的充分接觸和快速傳質(zhì)， 可有效提高萃取效率. 綜上述， 萃取溫度(A)、 萃取劑體積(B)、 鹽濃度(C)、 pH值(D)、 攪拌速度(E)等因素對(duì)體系的萃取效果都有相互的影響. 因此， 采用5因素4水平正交試驗(yàn)(見(jiàn)表1)， 共設(shè)計(jì)16個(gè)實(shí)驗(yàn)組(見(jiàn)表2)， 以考察各因素對(duì)萃取效果影響的主次順序， 尋求最優(yōu)萃取方案. 表3為SFODME法正交實(shí)驗(yàn)的極差分析.

表1 因素水平表

表2 SFODME法的正交實(shí)驗(yàn)方案表

表3 SFODME法正交實(shí)驗(yàn)極差分析

續(xù)表

分析物試驗(yàn)指標(biāo)因素ABCDEIBAK154884938700479055599K229823885387139974357K333372221256620883623K437154478208115321943k113721235175119761400k27469719689991089k3834555642522906k49291120520383486R62668012311593914

注：K值表示每個(gè)因素下對(duì)應(yīng)水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果之和；k是K的均值；R表示極差， 就是每個(gè)因素下K的最大值與最小值之差.

表3的極差分析中， 極差越大表明該因素對(duì)結(jié)果的影響越顯著. 試驗(yàn)表明， 溶液的pH值對(duì)2種生長(zhǎng)素的萃取效果影響最大， 其次是鹽濃度， 而溫度對(duì)萃取效果的影響最弱. 這是因?yàn)镮PA和IBA結(jié)構(gòu)上帶有一個(gè)羧基， 其pKa值分別為6.15和4.80. 在pH 3.0溶液中， 2種待測(cè)物大部分以非離子形式存在， 易于被十二醇萃取和富集. 萃取過(guò)程的其他條件為： 50 μL十二醇為萃取劑， 鹽濃度為0.25 g·mL-1NaCl， 萃取溫度和攪拌速率分別為26 ℃和1 800 r·min-1.

2.1.3 萃取時(shí)間

圖1 萃取時(shí)間對(duì)峰面積的影響Fig.1 Effects of extraction time on peak areas

恰當(dāng)?shù)妮腿r(shí)間能保證待測(cè)物在有機(jī)溶劑和樣品溶液中達(dá)到動(dòng)態(tài)平衡. 將上述樣品溶液分別攪拌萃取5、 10、 20、 30、 50 min后進(jìn)樣分析(其他實(shí)驗(yàn)條件： 50 μL十二醇， 20.0 mL溶液， 萃取溫度26 ℃， 攪拌速度1 800 r·min-1， 0.25 g·mL-1NaCl， pH 3.0， 樣品濃度為10 ng·mL-1)， 比較不同萃取時(shí)間對(duì)峰面積的影響， 見(jiàn)圖1. 結(jié)果表明， 萃取效率在10 min已達(dá)到最大， 表明該SFODME能實(shí)現(xiàn)較快速地萃取. 當(dāng)萃取50 min后， 2種生長(zhǎng)素的峰面積仍基本恒定， 萃取體系穩(wěn)定性好.

2.2 SFODME的方法評(píng)價(jià)2.2.1 重現(xiàn)性

方法重現(xiàn)性以日內(nèi)精密度來(lái)評(píng)價(jià)， 計(jì)算保留時(shí)間和峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD). 實(shí)驗(yàn)先以0.5 μg·mL-1標(biāo)樣在同一天內(nèi)連續(xù)5次進(jìn)樣測(cè)定， 再取5份10 ng·mL-1樣品溶液經(jīng)SFODME法萃取后當(dāng)天內(nèi)分析. 上述結(jié)果比較可得， 標(biāo)樣直接分析法重現(xiàn)性很理想， SFODME預(yù)處理法的保留時(shí)間RSDs在2.33%～2.56%范圍內(nèi)， 峰面積RSDs介于7.92%～8.66%， 表明該前處理技術(shù)穩(wěn)定、 重現(xiàn)， 符合分析方法的要求(見(jiàn)表4).

表4 SFODME方法的重現(xiàn)性(n=5)

2.2.2 富集效果

圖2 SFODME萃取前和萃取后響應(yīng)對(duì)比圖 Fig.2 The effect of corresponding method before SFODME and after SFODME extraction

富集能力是衡量前處理方法優(yōu)劣的一項(xiàng)重要指標(biāo). 在SFODME方法中， 磁力攪拌使萃取劑迅速分散成無(wú)數(shù)小液滴， 與樣品溶液和目標(biāo)物大面積混合. 劇烈的擾動(dòng)效應(yīng)增強(qiáng)了各溶劑間的穿透力和傳質(zhì)過(guò)程， 促使待測(cè)物進(jìn)入萃取劑， 因此SFODME能實(shí)現(xiàn)高效萃取和富集. 對(duì)比0.5 μg·mL-1標(biāo)樣直接進(jìn)樣和10 ng·mL-1樣品溶液經(jīng)SFODME法萃取后進(jìn)樣測(cè)定的結(jié)果. 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)， 盡管初始濃度相差50倍， 經(jīng)富集后2種待測(cè)物的響應(yīng)遠(yuǎn)高于萃取前的響應(yīng)(見(jiàn)圖2). SFODME的富集倍數(shù)(EF)公式為： EF=Cf/C0， 其中Cf為富集后萃取劑中待測(cè)物濃度；C0為樣品溶液中待測(cè)物初始濃度. 經(jīng)計(jì)算， 實(shí)驗(yàn)中IPA和IBA的富集倍數(shù)分別為300和310， 顯示SFODME技術(shù)具有強(qiáng)富集能力.

2.3 SFODME-HPLC檢測(cè)2種生長(zhǎng)素2.3.1 分析方法參數(shù)

在最優(yōu)條件下， 建立SFODME-HPLC分析法用于2種生長(zhǎng)素的檢測(cè). 配制各濃度的加標(biāo)水溶液， 以峰面積為縱坐標(biāo)、 濃度為橫坐標(biāo)， 擬合工作曲線. 方法的分析參數(shù)見(jiàn)表5， 檢測(cè)限低達(dá)0.01 ng·mL-1. 日內(nèi)精密度以同一天內(nèi)連續(xù)5次進(jìn)樣(0.2 ng·mL-1加標(biāo)水樣進(jìn)行萃取)來(lái)計(jì)算峰面積RSD， 日間精密度以連續(xù)5 d進(jìn)樣分析來(lái)評(píng)價(jià). 2種物質(zhì)峰面積RSDs小于7.35%， 表明該方法重現(xiàn)性良好.

表5 SFODME-HPLC方法的線性范圍、 檢測(cè)限及精密度

2.3.2 樣品分析及回收率實(shí)驗(yàn)

圖3 培養(yǎng)基實(shí)際樣品和加標(biāo)樣品(2 ng·mL-1)的色譜圖Fig.3 Chromatograms of culture media sample and spiked sample (2 ng·mL-1)

植物培養(yǎng)基干粉為實(shí)際樣品. 稱(chēng)取3 g干粉用100 mL二次水加熱攪拌溶解、 稀釋. 該培養(yǎng)基稀釋液經(jīng)過(guò)SFODME萃取后進(jìn)樣， 測(cè)得富集后IBA含量為 0.17 mg·L-1. 經(jīng)計(jì)算， 該培養(yǎng)基空白溶液中初始IBA濃度為0.55 ng·mL-1， 原干粉中IBA含量約為18 ng·g-1. 添加不同濃度的IBA、 IPA標(biāo)準(zhǔn)混合溶液， 進(jìn)行SFODME-HPLC分析(見(jiàn)圖3). 結(jié)果表明， 2種生長(zhǎng)素的回收率在84.3%～125.9%之間， RSDs<5.1%(見(jiàn)表6). 因此， 方法準(zhǔn)確、 可靠， 可應(yīng)用于實(shí)際樣品中生長(zhǎng)素的測(cè)定.

表6 2種生長(zhǎng)素培養(yǎng)基加標(biāo)回收率(n=3)

3 結(jié)論

研究采用正交實(shí)驗(yàn)優(yōu)化萃取條件， 建立了SFODME-HPLC-FLD 新方法檢測(cè)兩種常見(jiàn)的植物生長(zhǎng)素. 方法靈敏度高(檢測(cè)限為0.01 ng·mL-1)、 消耗有機(jī)溶劑少(僅微升級(jí))、 操作簡(jiǎn)單快速(10 min完成萃取)， 能用于實(shí)際樣品測(cè)定. 將此新技術(shù)與更多儀器聯(lián)用， 用于各種復(fù)雜體系中痕量成分的分析應(yīng)具有良好的應(yīng)用前景.

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(責(zé)任編輯： 洪江星)

Analysis of auxins by solidification of floating organic drop combined with high-performance liquid chromatography

LU Qiaomei1, 2, ZHANG Wenmin2, HUANG Chuanhui2, LU Minghua2, LI Jianrong3, 4, ZHANG Lan1, 2

(1. Analytical and Testing Center, Fuzhou University, Fuzhou, Fujian 350002, China; 2. Ministry of Education Key Laboratory of Analysis and Detection for Food Safety， Fuzhou University, Fuzhou, Fujian 350116, China;3. College of Food Science and Biotechnology, Zhejiang Gongshang University, Food Safety Key Laboratory of Zhejiang Province, Hangzhou， Zhejiang 310035, China; 4. Food Safety Key Laboratory of Liaoning Province,Bohai University, Jinzhou, Liaoning 121013, China)

Determination of two anxins (indole propionic acid and indole butyric acid) by solidification of floated organic drop microextraction with high-performance liquid chromatography-fluorescence detection (SFODME-HPLC-FLD) was established. The experimental conditions affecting the extraction process were optimized. The optimal conditions of SFODME were as follows: 50 μL dodecanol as extraction solvent, 20.0 mL sample solution with pH 3.0 and 0.25 g·mL-1NaCl. The above solution was extracted for 10 min at temperature of 26 ℃ and centrifugation speed of 1 800 r·min-1. Results showed that this SFODME approach had high sensitivity and good reproducibility, with relative standard deviations lower than 8.66%. Its linear range was 0.02～60 ng·mL-1, with the limit of detection of 0.01 ng·mL-1and the recoveries larger than 84.3%. This method was rapid, stable and environmentally benign, and it can be applied to real sample analysis.

solidified floating organic drop microextraction; high-performance liquid chromatography; liquid phase microextraction; auxin

10.7631/issn.1000-2243.2015.04.0554

1000-2243(2015)04-0554-06

2014-11-24

盧明華(1983-)， 助理研究員， 主要從事色譜質(zhì)譜分析、 藥物分析研究， 349762886@qq.com

“十二五”國(guó)家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目(2012BAD29B06)； 福建省自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目( 2010J05021)； 福州大學(xué)科技啟動(dòng)專(zhuān)項(xiàng)(600852)

O657.7

A