鄭永杰，尚明慧，田景芝，王志剛，徐偉慧

（1 齊齊哈爾大學化學與化學工程學院，黑龍江 齊齊哈爾 161006；2 齊齊哈爾大學生命科學與農(nóng)林學院， 黑龍江 齊齊哈爾 161006）

隨著工農(nóng)業(yè)的快速發(fā)展，廢棄物的排放導致水體富營養(yǎng)化現(xiàn)象愈發(fā)嚴重。水體污染中氨氮過高不僅導致水體惡臭，還會使魚類鰓、肝、腎等明顯受到損傷，生長受到限制間接危害人體健康[1]；硝氮含量過高會使人類特別是嬰兒血液中變性血紅蛋白增加引起高鐵血紅蛋白癥，甚至會致癌致死等[2]。為解決這一系列問題，全球范圍內(nèi)普遍采用生物脫氮技術改善水質(zhì)[3]。生物脫氮技術是在微生物作用下，將有機氮和NH3-N 轉(zhuǎn)化為N2和NxO 氣體的過程[4]，而水體的生物脫氮主要通過固定化菌株的方式進行。肖晶晶[5]通過篩選并固定化 AGMR 脫氮菌群顆粒，發(fā)現(xiàn)固定化菌群脫氮能力明顯優(yōu)于游離狀態(tài)。張會萍等[6]以陶粒為載體對高效脫氮菌群進行固定化，并通過多次富集，最后獲得了脫氮率級高的陶粒固定化脫氮菌群。劉少敏等[7]用聚乙烯醇/海藻酸鈉作為包埋載體固定硝化細菌，對生活污水中氨氮的去除效果顯著。Pranee 等[8]運用生物聚合殼聚糖對亞硝酸氧化菌進行固定化研究，其對亞硝氮有良好的去除效果等。本文提出的用二氧化硅（SiO2）和殼聚糖（CS）改性的Fe3O4磁性納米微球具有粒徑小、比表面積大、極性強的特點；磁性微球和表面帶有電荷的細菌之間通過靜電力結(jié)合來實現(xiàn)菌株的固定化，而且磁性對菌株有一定的穩(wěn)固與活化作用，并且可以在磁場的作用下實現(xiàn)分 離[9-10]。本文還利用微球磁性對菌株功能進行改善，通過吸附與微膠囊包埋雙重作用固定化功能性脫氮菌株，并研究其脫氨氮與硝氮性能，為進一步應用提供理論基礎與技術支撐。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

（1）菌株來源 實驗室篩選的具有脫氮性能的Enterobacter hormaechei QDTN-34 菌株，該菌株保藏在中國典型培養(yǎng)物保藏中心（CCTCC M 2013670）。

（2）反硝化培養(yǎng)基 C6H5Na3O7·2H2O，3.00g；KNO3，0.7210g；KH2PO4，1.0g；MgSO4·7H2O，1.0g；蒸餾水1000mL，pH=7.0，121℃滅菌20min。

（3）異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基 C6H5Na3O7·2H2O，5.0g；(NH4)2SO4，0.45g；K2HPO4，0.25g；FeSO4·7H2O，0.0025g；NaCl 0.125g；MgSO4，0.06g；MnSO4·H2O，0.001g；蒸餾水1000mL，pH=7.0，121℃滅菌20min。

1.2 共沉淀法制備Fe3O4 磁性納米微球

將5.406gFeCl3·6H2O 和2.7803gFeSO4·6H2O 溶于100mL 水中混勻，在80℃下劇烈攪拌30min，期間緩慢加入NH4·H2O 至pH≈10。反應完全后分離固相，將分離物用乙醇洗滌3 次后水沖洗至中性，60℃下真空干燥24h，備用，記為FG。

1.3 溶劑熱法制備Fe3O4 磁性納米微球

分別稱取2.20g FeCl3·6H2O、5.40g NaAc 和0.20g 檸檬酸鈉，將其溶解于25mL 的乙二醇中，磁力攪拌至全部溶解。將溶液轉(zhuǎn)移至內(nèi)襯為聚四氟乙烯100mL 的反應釜中，封好后將反應釜放入鼓風干燥箱中進行梯度加熱：0～80℃反應2h，80～150℃反應10h，150～200℃反應4h。冷卻后將產(chǎn)物用磁鐵分離，得到的黑色沉淀分別用乙醇和蒸餾水沖洗數(shù)次，最后用蒸餾水沖洗至中性，60℃下真空干燥24h，備用，記為FR。

1.4 Fe3O4@SiO2 磁性微球的制備

將0.1g FR 與0.1gFG 分別超聲擴散在40mL 乙醇中，加入1.0mL TEOS、2.5mL(3-氯丙基)三甲氧基硅烷和0.2mLTrition-100，超聲10min，再加入10mL 去離子水，超聲10min。加入1.0mL NH3·H2O（質(zhì)量分數(shù)28%），超聲至混合均勻后30℃劇烈攪拌2h。反應完全后，磁分離固相經(jīng)乙醇洗滌3 次再用水沖洗至中性，與60℃下真空干燥24h，備用，記為FR@SiO2與FG@SiO2。

1.5 Fe3O4@SiO2@CS 的制備

稱取FR@SiO2與FG@SiO2各0.1g ，超聲分散于50mL 殼聚糖溶液中（質(zhì)量分數(shù)0.5%），將水相中緩慢滴加50mL 液體石蠟、7mL 石油醚、7mL Trition-100 混合物，劇烈攪拌1h 后，加入10mL 1.0%戊二醛交聯(lián)1h。反應結(jié)束后磁分離沉淀物，用乙醇和丙酮分別沖洗3 次，在60℃下真空干燥24h，備用，記為FR@SiO2@CS 與FG@SiO2@CS。

1.6 改性Fe3O4@SiO2@CS 對QDTN-34 菌株的吸附試驗

在3 個等體積的錐形瓶中分別加入10mL OD600為0.1 的菌懸液，分別記為1 號、2 號、3 號。1 號瓶中不加入任何物質(zhì)（參比）；2 號瓶中加入0.01g FG@SiO2@CS 磁性微球；3 號瓶中加入 0.01g FR@SiO2@CS 磁性微球。在10℃震蕩下，分別在0min、5min、10min、20min、30min、45min、60min

時用紫外分光光度法在600nm 波長下檢測吸附前后菌液的吸光度變化，計算吸附率并通過血球計數(shù)法[11]計算出菌株個數(shù)。

1.7 PVA/海藻酸鈉-CS 固定化微膠囊包埋載體的制備

稱取一定量的聚乙烯醇（PVA）溶于100mL 沸水中，向溶液中加入3%的海藻酸鈉，加熱溶解后冷卻至27℃。將吸附菌株的兩種Fe3O4@SiO2@CS磁性微球分別加入到包埋材料中，使磁性微球與包埋材料按1∶2 混勻，用注射器注入到含有0.5%CS與4%CaCl2的溶液中，攪拌鈣化一段時間后，加入1mL 1.0%的戊二醛交聯(lián)2h。反應結(jié)束后，用生理鹽水進行沖洗3 次，冷藏備用。

1.8 固定化載體在水中的脫氮性能

1.8.1 脫氨氮的性能測定

取2 個錐形瓶分別加入100mL NH4+-N 濃度為100mg/L 的異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基，記為a 瓶、b 瓶。在a瓶中加入10mL OD600為0.1 的菌懸液；在b 瓶中加入10mL 的固定化載體。27℃下恒溫震蕩48h，每4h 取2mL 于600nm 波長處測定菌體的光密度值，再將樣品4000r/min 離心10min，取上清液用納氏試劑分光光度法[12]在波長420nm 下比較兩瓶溶液中氨氮的含量。

1.8.2 脫硝氮的性能測定

取2 個錐形瓶分別加入100mL NO3+-N 濃度為100mg/L 的反硝化培養(yǎng)基，記為c 瓶、d 瓶。在c瓶中加入10mL OD600為0.1 的菌懸液；在d 瓶中加入10mL 的固定化載體。27℃下恒溫震蕩48h，每4h 取2mL 于600nm 波長處測定菌體的光密度值，再將樣品4000r/min 離心10min，取上清液用紫外分光光度法[13]在波長220nm 下比較溶液中硝氮的 含量。

2 結(jié)果與討論

2.1 反應機理

在溶劑熱法制備單分散Fe3O4顆粒過程中，穩(wěn)定劑乙酸鈉分布在Fe3O4表面，其中羧基使Fe3O4在乙二醇中有很好的分散性。加入(3-氯丙基)三甲氧基硅烷偶聯(lián)劑，NH4+使Fe3O4表面包覆的SiO2更加穩(wěn)定，再通過反相乳液分散-化學交聯(lián)法[14]獲得均勻包覆有殼聚糖的Fe3O4磁性微球，此時微球表面呈陽性，會更容易吸附帶有負電荷的菌株[18]。包覆原理如圖1 所示。

圖1 反應機理圖

2.2 Fe3O4 磁性納米粒子的表征

圖2(a)、(b)為共沉淀法與溶劑熱法制備的Fe3O4的SEM 圖像。(a)中納米粒子呈相對規(guī)則的球形，顆粒尺寸均一，但團聚現(xiàn)象較為嚴重；(b)中磁性納米顆粒形狀較規(guī)則，呈球形，且相對單一分散。圖2(c)為溶劑熱法制備的Fe3O4TEM 圖像，從圖中可以看出納米粒子分散良好，平均粒徑為200nm 左右；圖2(d)為Fe3O4@SiO2TEM 圖像，可以看出粒子外圍包覆了一層30nm 左右的SiO2；圖2(e)為Fe3O4@SiO2@CS TEM 圖像，可以看出包覆有CS的磁性微球分散性良好，能明顯地看出殼核結(jié)構，平均粒徑在300nm。綜上所述，在制備方法上溶劑熱法制備的Fe3O4納米粒子（FR）及包覆是較理想的狀態(tài)，以下的試驗會以溶劑熱法制備的Fe3O4及改性材料為主要研究對象[15]。

圖3 為用溶劑熱法制備的檸檬酸鈉磁性粒子Fe3O4、Fe3O4@SiO2及Fe3O4@SiO2@CS 的紅外對比圖。圖中位于3433cm-1處的震動峰分別屬于O—H 鍵；在1631cm-1和1395cm-1處的伸縮振動峰屬于—COOH，這也證明了Fe3O4粒子的表面存在羧基基團，在586cm-1處的振動峰為典型的Fe—O 鍵，同時在700cm-1處無亞鐵氧鍵的特征吸收峰，說明樣品為純相Fe3O4；在Fe3O4@SiO2圖中，位于1110cm-1和791cm-1處的峰位分別對應為Si—O—Si 的反對稱及對稱伸縮振動峰；位于1629cm-1和971cm-1的峰歸屬于表面Si—OH 的振動峰，這可以得出SiO2成功包覆于Fe3O4微球表面，在2924cm-1處是—NH 的伸縮振動吸收峰，表明—NH 成功接在磁性微球表面；在Fe3O4@SiO2@CS 圖中，1076cm-1處有明顯的C—O—C 伸縮振動峰，說明殼聚糖已共價結(jié)合到磁性Fe3O4納米粒子上。

圖2 Fe3O4 磁性納米粒子的SEM 及TEM 圖像

圖3 Fe3O4 磁性微球紅外圖

圖4 為用溶劑熱法制備的檸檬酸鈉磁性 Fe3O4納米粒子的XRD 譜圖。通過與Fe3O4的標準XRD譜圖比較，在18.8°、 30.11°、35.45°、43.13°、53.54°、56.93°、62.54°、70.34°和74.21°左右出現(xiàn)了9 個特征衍射峰，分別對應立方相(111)、(220)、(311)、(400)、(422)、(511)、(440)、(620)、(533)且主要衍射峰較尖銳，表明樣品為反尖晶石型 Fe3O4且晶型良好[16-17]。

圖4 Fe3O4 磁性微球XRD 圖

圖5 為溶劑熱法制備的Fe3O4、Fe3O4@SiO2及Fe3O4@SiO2@CS 的熱重對比圖。圖中20～150℃之間的質(zhì)量減少是由于水和小分子溶劑的分解所引起;當溫度200℃時， Fe3O4和Fe3O4@SiO2開始失重但不明顯；當達到800℃時，二者分別失重8.23%、10.28%。Fe3O4@SiO2@CS 磁性微球在150℃時開始失重，當達到 250℃左右時，樣品質(zhì)量減輕最為迅速，此時共價結(jié)合到磁性Fe3O4@SiO2納米微球上的殼聚糖迅速分解，單位時間內(nèi)分解量達到最大，隨溫度的不斷升高，結(jié)合到磁性微球上的物質(zhì)逐漸分解，熱重分析顯示質(zhì)量損失約占 42.07%。根據(jù)上述結(jié)果可以得出，F(xiàn)e3O4納米粒子表面小分子活性基團的接枝率為8.23%，F(xiàn)e3O4@SiO2表面活性基團接枝率為2.05%，CS 表面接枝率為31.79%。

圖5 Fe3O4 磁性微球熱重圖

圖6 為振動磁強計VSM 對Fe3O4磁性納米粒子的磁學性能對比圖。從圖中可知，溶劑熱法制備得到的Fe3O4樣品的剩磁強度M 約為1.7emu/g，磁飽和強度Ms約為62.7emu/g，磁矯頑力Hc約為11.1 Oe；Fe3O4@SiO2@CS 磁性納米粒子的磁飽和強度約為51.7emu/g，剩磁強度M 約為0.5emu/g，磁矯頑力Hc約為3.2Oe，占磁性 Fe3O4納米粒子飽和磁化強度的82.46%。這個結(jié)果進一步說明實驗合成的磁性 Fe3O4@SiO2@CS 微球具有較強的飽和磁化 強度。

圖6 Fe3O4 磁性微球磁學性能分析

2.3 改性Fe3O4@SiO2@CS 對脫氨除臭菌的吸附試驗

圖7 為Fe3O4磁性微球?qū)晡降膶Ρ仍囼瀳D?？梢钥闯?，溶劑熱法制備的FR@SiO2@CS 磁性微球?qū)甑奈剿俣容^快（3 號瓶），在20min時吸附率達85.0%，活菌吸附量達2.11×106cfu/mL；共沉淀法制備的FG@SiO2@CS 磁性微球?qū)甑奈剿俣容^前者相對較慢（2 號瓶），在30min 時達到最大值為67.7%，活菌吸附量為1.41×106cfu/mL，這也進一步證明FR 磁性粒子其分散與吸附性能優(yōu) 于FG 磁性粒子。這一結(jié)果與一些研究人員的結(jié)論相符，且吸附率與活菌吸附量相對良好[18]。當45min后，磁性微球的吸附性能有下降趨勢但并不明顯，這可能是當吸附到一定程度，微球表面的菌株逐漸團聚導致少量脫落現(xiàn)象所導致。

圖7 不同方法制備的Fe3O4@SiO2@CS 磁性微球?qū)晡铰逝c活菌量的對比

2.4 固定化微膠囊包埋載體

圖8 為包覆有Fe3O4@SiO2@CS（吸附菌株）磁性微球的PVA/海藻酸鈉-CS 微膠囊小球。圖8(a)微膠球呈球狀，外表光滑，直徑在400μm 左右。圖8(b)為飽和微膠囊剖面結(jié)構，從圖中可以清晰地看出，微膠囊的單核雙壁結(jié)構分別為PVA/海藻酸鈉復合膜與CS 膜，其殼厚度分別在120μm、30μm 左右。如圖8(c)、(d)可知 ，飽和的微膠囊小球直徑在2～3mm 左右，而脫水的膠球直徑在0.4～1.0mm 左右，水分占80%以上，這非常適合菌株生長，并為菌株提供良好的營養(yǎng)與水分[19]。

圖8 包覆有Fe3O4@SiO2@CS（吸附菌株）磁性微球的PVA/海藻酸鈉-CS 微膠囊小球

2.5 固定化載體在水中的脫氮性能

由圖9(a)可知，在18h 之前固定化的菌株生長速度較游離菌株相對較慢，其原因主要是固定化菌株需要一定的活化過程[7]。18h 后，固定菌株繁殖速度加快， 42h 左右達到穩(wěn)定期，OD600值達2.143，而游離菌株OD600值為1.630，說明在相同體積下固定化的菌株量比游離狀態(tài)的菌株數(shù)量多。當氨氮初始濃度為100mg/L 時，固定化菌株在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中48h 的培養(yǎng)，培養(yǎng)基中氨氮的濃度從100mg/L下降到27.73mg/L，去除率達72.26%；游離菌株在異養(yǎng)硝化培養(yǎng)基中48h 的培養(yǎng)，培養(yǎng)基中氨氮的濃度從100mg/L 下降到45.87mg/L，去除率達54.13%。這也進一步說明了在相同體積下固定化菌株量大于游離狀態(tài)，具有良好的脫氨氮效果。由圖9(b)可知，相同體積下固定化菌株量仍然大于游離狀態(tài)，OD600最大值達2.116。在硝氮初始濃度為100mg/L 時，固定化菌株通過48h 的培養(yǎng)，培養(yǎng)基中硝氮的濃度從100mg/L 下降到25.44mg/L，去除率達74.56%；游離菌株在反硝化培養(yǎng)基中培養(yǎng)48h，培養(yǎng)基中氨氮的濃度從100mg/L 下降到40.83mg/L，去除率達 59.17%。以上均說明固定化菌株能更好了去除培養(yǎng)基中的氨氮與硝氮。

圖9 菌株固定化膠球在培養(yǎng)基中生長及脫氨氮與硝氮 能力

3 結(jié) 論

（1）本研究運用共沉淀與溶劑熱兩種方法合成Fe3O4磁性納米粒子并進行對比實驗，結(jié)果顯示溶劑熱法制備的磁性粒子分散性優(yōu)于共沉淀法。

（2）對Fe3O4磁性納米粒子進行改性實驗，(3-氯丙基)三甲氧基硅烷做偶聯(lián)劑使SiO2很好的共價結(jié)合到磁性粒子表面，再通過反相乳液分散-化學交聯(lián)法包覆殼聚糖，制備的磁性微球形狀較均勻、分散性較好、粒徑為 300nm 左右，殼聚糖在磁性納米粒子表面的接枝率達 31.79%。

（3）改性后的溶劑熱Fe3O4磁性納米微球?qū)甑奈侥芰?yōu)于改性后共沉淀法制備的Fe3O4磁性納米微球。FR@SiO2@CS 吸附20min 時，磁性微球?qū)甑奈铰蔬_到最大值為85%，活菌量為2.11×106cfu/mL；FG@SiO2@CS 吸附30min 時，磁性微球?qū)甑奈铰蔬_到最大值為67.7%，活菌量為1.41×106cfu/mL。

（4）研究發(fā)現(xiàn)固定化菌株比游離態(tài)菌株有更好的脫氮效果。在相同體積下，通過吸附-包埋的QDTN-34 菌株穩(wěn)定期時其OD600在2.1～2.2 之間，48h 后對氨氮和硝氮的去除率分別達到72.26%和74.56%；游離狀態(tài)的QDTN-34 菌株到達穩(wěn)定期時其OD600為1.630，48h 后對氨氮和硝氮的去除率分別為54.13 %和59.17%。

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