喬楠，陳瑞佳，于大禹

（1 東北電力大學(xué)建筑工程學(xué)院，吉林 吉林 132012；2 東北電力大學(xué)化學(xué)工程學(xué)院，吉林 吉林 132012）

隨著環(huán)境水體富營養(yǎng)化問題的日益嚴(yán)重，人們對排放污水的脫氮問題愈加重視。近年來，一種新型脫氮菌，即異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌逐漸成為污水脫氮領(lǐng)域的研究熱點。該菌可同時將硝化和反硝化過程在一個反應(yīng)器中完成，克服了傳統(tǒng)脫氮工藝高成本、高耗能、低效率等問題，因此具有很大的研究價值和應(yīng)用前景。

目前，已陸續(xù)有不同分屬的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌如不動桿菌、紅球菌、枯草芽孢桿菌等被從不同環(huán)境中分離出來[1-2]。對其開展的研究也多集中于菌株的脫氮特性及機(jī)理，有研究者對一株好氧反硝化菌H1 的脫氮性能及機(jī)理進(jìn)行了初步研究[3]，發(fā)現(xiàn)在有氧條件下，該菌可在氨單加氧酶的作用下將NH4+-N 氧化為NH2OH，再經(jīng)過羥胺氧化酶的作用將其轉(zhuǎn)化為N2O，以氣體形式逸出水體，提高了對NH4+-N 的降解效率，但對其實際應(yīng)用有待進(jìn)一步探索。固定化技術(shù)能夠解決實際脫氮工藝中菌體流失、脫氮穩(wěn)定性差等問題[4]，目前對于異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌的固定化已有一定的研究基礎(chǔ)，使用過的材料包括活性炭、納米Fe3O4、聚乙烯醇等[5-6]，尋求高效、廉價、耐用且無二次污染的菌株固定化載體成為進(jìn)一步推進(jìn)該菌應(yīng)用研究的關(guān)鍵。硅藻土是一類廉價好用的吸附劑，其表面具有大量的、有序排列的微孔，從而具有很大的比表面積[7]，將其作為生物載體應(yīng)用于廢水處理中，由于硅藻土本身可以吸附污染物，因此可以達(dá)到強(qiáng)化生化反應(yīng)的效果，極具應(yīng)用價值[8]。本實驗采用經(jīng)適當(dāng)改性后的硅藻土負(fù)載異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌，優(yōu)化固定化條件的同時考察不同環(huán)境因素對固定化菌脫氮性能的影響，之后將該固定化菌投入到反應(yīng)器中處理生活污水，研究其脫氮效果及穩(wěn)定性。

1 材料方法

1.1 材料

（1）實驗菌種 H1（實驗室自篩），經(jīng)測定該菌種具有異養(yǎng)硝化和好氧反硝化性能，經(jīng)菌株鑒定為假單胞菌[9]。

（2）H1 生長培養(yǎng)基 KNO3，0.6g/L；KH2PO4，1.0g/L；MgSO4·7H2O，1.0g/L；琥珀酸鈉，2.4g/L；pH7.0。

（3）NH4+模擬廢水 (NH4)2SO4，0.35g/L；KH2PO4，0.75g/L；K2HPO4·3H2O，2.216g/L；MgSO4·7H2O，0.025g/L；檸檬酸三鈉，1.81g/L；pH7.0。

（4）生活廢水 取自吉林市長春路旁居民樓生活廢水。其中總氮含量為70～75mg/L；COD 含量為470～481mg/L；氨氮含量為41～46mg/L。

1.2 方法

1.2.1 分析檢測項目及方法

參照《水和廢水監(jiān)測分析方法》[10]，其中：總氮（TN），過氧化鉀氧化-紫外分光光度法；氨氮 （NH4+-N），納氏試劑分光光度法；硝態(tài)氮（NO3--N），紫外分光光度法；亞硝態(tài)氮（NO2--N），N-(1-萘基)-乙二胺光度法；COD，重鉻酸鉀法；菌懸液中微生物數(shù)量，稀釋平板計數(shù)法。

1.2.2 H1 的固定化

（1）硅藻土的改性[11-12]①取50g 硅藻土在200℃下干燥4h，冷卻至室溫后按2.5∶1 的液固比稱取硅藻土和水，攪拌均勻后加入濃度為40%硫酸，水浴溫度100℃條件下充分?jǐn)嚢?h，過濾后用除鹽水洗滌至中性，105℃下烘干；②向其中加入一定濃度的碳酸鈉溶液，邊攪拌邊滴加飽和氯化鈣溶液，反應(yīng)結(jié)束后真空抽濾；③將干燥后的硅藻土與FeSO4按一定的質(zhì)量配比加入除鹽水中，30℃下以150r/min 的速度攪拌2h，過濾，干燥2h 即得到改性硅藻土。

（2）菌株H1 的負(fù)載 取經(jīng)搖床培養(yǎng)24h 的菌懸液300mL，3000r/min 離心20min，PBS 緩沖液洗滌3 次后，使用無菌水稀釋至50mL，根據(jù)不同實驗要求加入改性硅藻土，改變實驗條件，在恒溫水浴搖床中120r/min 振蕩進(jìn)行吸附實驗，溶解氧（dissolved oxygen，DO）控制在5.0mg/L，待硅藻土顆粒沉降完全后吸取上清液并稀釋，接種到平板恒溫培養(yǎng)，48h 后對平板上的菌落計數(shù)為C1，初始菌懸液菌落計數(shù)為C0，根據(jù)公式Q1= (C0-C1)/C0× 100%，計算出菌體固定化率。

1.2.3 環(huán)境因素對固定化H1 脫氮效果的影響

抗環(huán)境干擾能力是衡量固定化菌脫氮性能的重要指標(biāo)，因此本實驗研究比較了DO 濃度分別為1.4mg/L、5.1mg/L、6.8mg/L；溫度分別為10℃、20℃、30℃、40℃、50℃，pH 值分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0 條件下，游離菌及固定化H1 在反應(yīng)器中對NH4+模擬廢水的處理效果，24h 后檢測水中NH4+-N、NO3--N、NO2--N 及COD 的變化。

1.2.4 實驗裝置

本實驗裝置如圖1 所示，由好氧區(qū)、固液分離區(qū)組成。好氧區(qū)容積為5.0L，固液分離區(qū)容積為0.7L，好氧區(qū)投加改性硅藻土固定化菌，在底部一側(cè)布置曝氣頭，DO 控制在6mg/L，溫度控制在 25℃。

圖1 實驗裝置圖

1.2.5 改性硅藻土固定化H1 連續(xù)式處理生活污水

調(diào)節(jié)蠕動泵，控制進(jìn)水流速為2mL/min，連續(xù)對廢水進(jìn)行14 天的處理，共處理40L 污水，一次性投加10g 負(fù)載H1 的硅藻土，每隔24h 將分離室中沉降的硅藻土回流到反應(yīng)室中，DO 控制在6.0mg/L 左右，每隔24h 監(jiān)測水中TN、NH4+-N、NO2--N 及COD 的變化。

2 結(jié)果與討論

2.1 改性硅藻土固定化H1 效能的研究

2.1.1 吸附時間（t）及硅藻土用量對H1 固定化效果的影響

m(FeSO4)/m(硅藻土)=5.0%、溫度為 30℃、pH=7.0 時，采用1.2.2 節(jié)方法考察時間及硅藻土用量對H1 固定化效果的影響。實驗結(jié)果見圖2。

從圖2(a)可以看出，隨著時間的增加，硅藻土對菌株的固定化率呈先上升后下降的趨勢，在初始時間里，吸附過程較快，孔道效應(yīng)明顯；在18h 后，吸附效率下降；又經(jīng)6h，硅藻土對于菌株H1 的吸附已達(dá)到飽和狀態(tài)，固定化率達(dá)到最大為68.16%；如果增加時間超過30h，固定化率反而下降，這可能是由于環(huán)境中營養(yǎng)物質(zhì)匱乏，菌株無法進(jìn)行生長增殖，菌與菌之間的黏結(jié)力下降，在搖床振蕩條件下H1 逐漸從硅藻土表面脫落，因此選定固定化時間為24h。從圖2(b)可以看出，硅藻土用量的增加提供了更多的吸附孔道和比表面積，因而吸附量也隨之增加，在菌懸液濃度一定條件下，當(dāng)投加量為0.06g/mL 時，固定化率達(dá)到63.84%；當(dāng)投加量繼續(xù)增加時，固定化率下降到45.16%，這可能是由于在本實驗所設(shè)的吸附條件下，繼續(xù)增加硅藻土投加量反而會降低其懸浮效果，使部分硅藻土處于沉降狀態(tài)，降低與菌體的接觸效率，因此選定改性硅藻土用量為0.06g/mL。

圖2 改性硅藻土固定化H1 條件優(yōu)化

使用改性硅藻土對H1 進(jìn)行固定化時，由于硅藻土本身物化特性及菌體代謝活性都會受到環(huán)境條件的影響，除pH 值及溫度外，在本實驗中，硅藻土改性時使用的FeSO4劑量也會影響菌體活性，因此本研究結(jié)合菌體固定化率及固定化菌的脫氮性能，考察分析了Fe2+加入量、pH 值、溫度及DO 對固定化H1 效能的影響。

2.1.2 FeSO4劑量對固定化菌H1 效能的影響

溫度為30℃、投加量為0.06g/mL、固定化時間為24h、pH=7.0、DO=5.0mg/L、硅藻土質(zhì)量一定時，設(shè)置FeSO4占硅藻土質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為10.0%、7.0%、5.0%、3.0%、2.5%、2.0%、0，考察不同用量FeSO4的條件下，改性硅藻土顆粒對H1 固定化及生化活性的影響。實驗結(jié)果見表1。

表1 的結(jié)果顯示，加入FeSO4能夠明顯改善固定化率，當(dāng)m(FeSO4)/m(硅藻土)=0 時，即不添加FeSO4進(jìn)行改性，固定化率僅為 38.02%；而m(FeSO4)/m(硅藻土)=2.5%時，H1 負(fù)載率提升到60.91%，這是由于加入的Fe2+取代了硅藻土表面的硅羥基，使得硅藻土表面帶有正電荷，這樣提升了對菌體的吸附性。當(dāng)m(FeSO4)/m(硅藻土)=3.5%時，在上述實驗條件下，固定化率基本保持恒定，為59.75%，但固定化菌對NH4+-N 的去除率達(dá)到最高，為61.62%，表明此時固定化H1 活性更強(qiáng)。據(jù)之前報道，金屬離子能夠通過共價作用來激活酶的催化能力，適量的Fe2+會對菌株異養(yǎng)硝化過程有一定激活作用，通過激發(fā)異養(yǎng)硝化過程中關(guān)鍵的溶解性單體周質(zhì)酶及羥胺氧化酶的活性來提高脫氮效果[3]，可見經(jīng)改性后的硅藻土對菌株的吸附效果不僅增強(qiáng)，同時強(qiáng)化了菌株的脫氮性能。此外，隨著m(FeSO4)/m(硅藻土)增加到5.0%，固定化率也上升到62.10%，但固定化H1 對NH4+-N、CODCr的降解率出現(xiàn)明顯下降，雖然Fe2+的加入提高了硅藻土對菌株的吸附效果，但過量的Fe2+可能會對H1 的活性造成一定影響[13]。根據(jù)以上實驗結(jié)果，選定硅藻土改性過程中，m(FeSO4)/m(硅藻土)的最佳比例為3.5%。

2.1.3 pH 值對固定化菌H1 效能的影響

m(FeSO4)/m(硅藻土)=3.5%、溫度為30℃、改性硅藻土投加量為0.06g/mL、固定化時間為24h，設(shè)置pH 值分別為5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0。圖2(c)為不同pH 值對H1 固定化率的影響；圖3 為不同pH 值對固定化H1 脫氮性能的影響。

從圖2(c)及圖3(a)可以看出，pH=5.0 時，固定化率僅為40.66%，固定化菌對NH4+-N 去除率也維持在較低水平，在偏酸條件下，由于硅羥基等活性基團(tuán)從硅藻土表面解離出來變得更加困難[14]，因而可能抑制了其對菌體的吸附，此時游離菌COD 降解率僅為70.30%，表明H1 在酸性條件下新陳代謝能力下降，不利于菌體表面活性官能團(tuán)在改性硅藻土表面微孔中的附著。由圖3(b)看出，投加固定化菌的廢水中 NO3--N 含量高達(dá) 0.68mg/L，表明NO3--N 的還原受到抑制，這可能是由于在酸性條件下，微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收及體內(nèi)的反硝化酶活性都相應(yīng)受到影響[15]。固定化過程改變了細(xì)胞的生長環(huán)境，載體對于固定于其中的微生物細(xì)胞起到了緩沖作用，因而在酸性條件下固定化H1 較游離態(tài)H1 效能有所提高，對NH4+-N 去除率達(dá)到65.30%。當(dāng)pH 值處于中性或弱堿性條件時，固定化率上升到65.97%，較pH=6 時對菌體的固定化率提高15%，固定化菌NH4+-N 降解率達(dá)到69.28%。

表1 不同m(FeSO4)/m(硅藻土)比例下H1 的固定化效果

圖3 不同pH 值下固定化H1 脫氮性能測定

2.1.4 溫度（T）對固定化菌H1 效能的影響

m(FeSO4)/m(硅藻土)=3.5%、改性硅藻土投加量為0.06g/mL、pH=7.5、固定化時間為24h 條件下，分別設(shè)定溫度為10℃、20℃、30℃、40℃、50℃，實驗結(jié)果見圖2(d)、圖4。

圖4 不同溫度下固定化H1 脫氮性能測定

結(jié)合圖2(d)、圖4(a)，在低溫環(huán)境下，外界溫度為10℃時，固定化率僅為50%，由于菌體代謝速率下降，導(dǎo)致對NH4+-N 降解率較低，僅為51%左右。從圖4(b)看出，NO3--N、NO2--N 出現(xiàn)積累，表明參與硝化及反硝化過程的各種酶活性都受到了不同程度的抑制，但相比之下固定化菌對NH4+-N的降解率較游離菌略有提升，為55.36%，表明載體在低溫條件下對菌體起到了一定保護(hù)作用，降低了低溫環(huán)境對菌體株的影響。隨著溫度升高，硅藻土表面硅羥基及H1 逐漸變得活躍，吸附效果也逐漸增強(qiáng)，在溫度接近30℃時，硅藻土對H1 的吸附趨于平衡階段，但當(dāng)溫度高于40℃時，圖4(a)、圖4(b)結(jié)果表明，NH4+-N 去除率出現(xiàn)明顯下降，同時NO2--N 含量有積累的趨勢，而NO3--N 并無明顯上升，說明相比于硝酸鹽還原酶，亞硝酸鹽還原酶對于高溫更加敏感[16]，而投加固定化菌的廢水中NO2--N 積累量更少，表明固定化菌較游離菌對高溫的耐受性增強(qiáng)，脫氮更徹底。

2.1.5 DO 對固定化H1 效能的影響

根據(jù)Wehrfritz 等[17]提出的異養(yǎng)硝化-好氧反硝化偶聯(lián)機(jī)制，O2在異養(yǎng)硝化過程中伴隨著氨單加氧酶（AMO）和羥胺氧化酶（HAO）參與反應(yīng)，同時在好氧反硝化過程中參與協(xié)同呼吸，是整個脫氮過程中必要的底物，因此是影響異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌脫氮效果的主要因素。至今發(fā)現(xiàn)的不同菌株對DO 敏感性也不盡相同，但針對DO 對于固定化菌的影響鮮有報道。本實驗通過調(diào)節(jié)曝氣泵的強(qiáng)度控制DO 分別為1.4mg/L、5.1mg/L 和6.8mg/L，采用1.2.4 節(jié)方法比較DO 對于固定化H1 及游離菌脫氮過程的影響。

從圖5(a)可以看出，隨著DO 濃度的升高，游離菌及固定化菌對NH4+-N 及COD 的去除率明顯增加，但圖5(b)表明，NO3--N、NO2--N 也隨之有較多積累，當(dāng)DO 從5.1mg/L 升高到6.8mg/L 時，游離菌及固定化菌NH4+-N 去除率分別增加22.08%和30.96%。根據(jù)之前報道，高濃度的DO 利于提高氨單加氧酶及羥胺氧化酶活性，但有可能改變了脫氮途徑，使得羥胺從可直接轉(zhuǎn)換為N2O 轉(zhuǎn)變?yōu)樾杞?jīng)反硝化過程（NH2OH→NO2-→NO3-→NO2-→N2O→N2）去除[18]。當(dāng)DO=6.8mg/L，固定化菌的NH4+-N 去除率可達(dá)69.01%，略高于游離菌，而NO3--N 及 NO2--N 含量分別為 2.05mg/L 和0.51mg/L，都遠(yuǎn)低于游離菌，因為硅藻土依靠吸附作用將菌株固定于其內(nèi)部和表面，菌體對于氧的消耗由外至內(nèi)形成了DO 梯度，內(nèi)部的缺氧或微氧區(qū)緩解了氧氣對于亞硝酸鹽還原酶的抑制，使得脫氮過程得以順利進(jìn)行，因此，硅藻土固定化H1 對于高濃度DO 有更強(qiáng)的耐受性，脫氮效率更高。

圖5 不同DO 條件下固定化H1 脫氮性能測定

2.2 硅藻土固定化H1 在反應(yīng)器中連續(xù)處理生活 污水

處理結(jié)果如圖6 所示。從圖6 中可以看出，反應(yīng)器啟動時間為5 天，在啟動期間，TN、NH4+-N、COD 去除率快速上升，NO2--N 含量波動較大；8天后，TN、NH4+-N去除率分別達(dá)到52.40%、55.64%，TN 去除率與NH4+-N 去除率基本保持同步，COD去除率為61.23%；8 天之后反應(yīng)器中氮碳污染物去除效果趨于穩(wěn)定，NO2--N 濃度在0.02mg/L 上下波動，維持在較低水平。實驗證明，利用硅藻土固定化異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌在一個反應(yīng)器中對生活污水有較好的連續(xù)處理效果。

3 結(jié) 論

（1）通過改性硅藻土對異養(yǎng)硝化-好氧反硝化菌H1 固定化的研究，確定了最佳固定化條件：吸附時間為24h，載體投加量為0.06g/mL，溫度為30℃，pH 值為7.5；同時發(fā)現(xiàn)當(dāng)m(FeSO4)/m(硅藻土)=3.5%時，固定化率及固定化后菌體活性較高，使用適量Fe2+改性后的硅藻土作為載體可強(qiáng)化菌株的異養(yǎng)硝化性能。

圖6 硅藻土固定化H1 連續(xù)處理生活污水 TN、NH4+-N、NO2--N 濃度及COD 去除率

（2）通過比較游離菌和固定化菌對環(huán)境因子耐受性的研究，結(jié)果表明在低溫和酸性條件下，載體對于H1 起到緩沖保護(hù)作用。相比于游離菌，當(dāng)DO升高時，投加固定化菌的NH4+模擬廢水中NO2--N積累量更少，脫氮效率更高，表明固定化菌對環(huán)境的耐受性更強(qiáng)。

（3）固定化菌在反應(yīng)器中連續(xù)運行8 天之后氮碳污染物去除效果趨于穩(wěn)定，并且沒有NO2--N 的積累，表明硅藻土固定化H1 適用于對污水的連續(xù)處理。

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