張筠婷，王綠婭

本研究創(chuàng)新點(diǎn):

家族性高膽固醇血癥 (FH)是一種異質(zhì)性疾病，有多種致病基因，連鎖分析作為致病基因的初篩方法之一，已被美國、丹麥、荷蘭等多個國家廣泛使用，而在我國并未廣泛推廣。其主要將基因組中與基因突變部位緊鄰的多態(tài)性位點(diǎn)作為標(biāo)記，利用凡帶有該標(biāo)記的成員可能攜帶致病基因的原理，對致病基因做出間接診斷。本研究在經(jīng)典連鎖分析基礎(chǔ)上，結(jié)合新的微衛(wèi)星位點(diǎn)和新型毛細(xì)管電泳儀，對FH進(jìn)行基因初篩，針對2個FH家系，得出致病基因，為后期的測序工作提供方向。

家族性高膽固醇血癥 (familial hypercholesterlolemia，F(xiàn)H)是一種較為常見的常染色體顯性遺傳性疾病，是單基因遺傳性高膽固醇血癥最常見的形式［1］。該病的雜合子發(fā)病率為1/500，純合子較為罕見僅為1/1 000 000。這種遺傳性的膽固醇代謝障礙通常導(dǎo)致過早發(fā)生動脈粥樣硬化而早發(fā)冠心?。?］。其主要臨床表現(xiàn)為血漿總膽固醇 (TC)，特別是低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平顯著升高，皮膚肌腱黃色瘤并伴有瓣膜反流等［3］。較其他類型的高脂血癥而言，F(xiàn)H患者出現(xiàn)心血管疾病的臨床表現(xiàn)更嚴(yán)重、更多樣，其危害性也更大。FH研究成為一大熱點(diǎn)，但我國對FH的研究報道較少。1974年 Goldstein等［4］提出，F(xiàn)H發(fā)病是由于低密度脂蛋白受體 (LDL-R)基因突變，引起細(xì)胞膜表面的LDL-R缺如或結(jié)構(gòu)功能異常，導(dǎo)致體內(nèi)低密度脂蛋白 (LDL)清除障礙并在組織內(nèi)過度淤積。隨著檢測手段的快速發(fā)展，目前已經(jīng)在世界各地發(fā)現(xiàn)了共1 741種突 變 (http://www.ucl.ac.uk/fh)。Jones 等［5］認(rèn) 為，F(xiàn)H的病因不應(yīng)僅考慮LDL-R基因突變，其他基因的突變也可導(dǎo)致典型的FH樣表型。在已排除LDL-R基因突變的患者中，已經(jīng)檢測到多種致病基因，包括載脂蛋白B100(apo-B100)基因和新發(fā)現(xiàn)的枯草溶菌素9(PCSK9)基因等。

目前已有報道顯示，LDL-R、apo-B100、PCSK9基因等多種基因突變均可導(dǎo)致FH［4-5］，因此應(yīng)采用一種快速、有效的基因篩查方法對FH患者進(jìn)行初篩，盡早明確FH患者與各種基因的相關(guān)性。連鎖分析作為遺傳學(xué)初篩的主要方法，已經(jīng)被美國、丹麥、荷蘭等國家廣泛使用［6］，國外針對FH的主要致病基因，即LDL-R基因以及新發(fā)現(xiàn)的PCSK9基因，采用家系連鎖分析的方法做了大量研究［7］。本研究也選用基因連鎖分析的方法進(jìn)行研究，并采用新的微衛(wèi)星位點(diǎn)和新型毛細(xì)管電泳儀，對經(jīng)典的連鎖分析方法有所突破，最終為后期的研究奠定了基礎(chǔ)。

1 對象與方法

1.1 研究對象 先證者1:男性，10歲，河南人，2010年6月以“高脂血癥”入院。身上多部位黃色瘤，1歲時發(fā)現(xiàn)高脂血癥，3歲時心功能Ⅱ級〔紐約心臟病協(xié)會 (NYHA)分級〕。6歲開始使用阿托伐他汀鈣片(立普妥)進(jìn)行降脂治療。心功能逐漸惡化，身上肌腱部位黃色瘤逐年增大。有黃色瘤家族史、冠心病家族史。

先證者2:男性，8歲，北方人，2010年7月以“高脂血癥”入院。身體多部位黃色瘤，如雙手腕、雙側(cè)跟腱、臀部等，并出現(xiàn)角膜弓;血清TC水平為23.00 mmol/L，LDL-C 水平為 20.10 mmol/L。其表姨媽生前患有嚴(yán)重的高膽固醇血癥，且皮膚多部位存在黃色瘤，已于15歲時患急性心肌梗死死亡。

根據(jù)陳在嘉等［8］主編的《臨床冠心病學(xué)》提出的FH診斷標(biāo)準(zhǔn):成人TC＞7.80 mmol/L，16歲以下兒童TC＞6.70 mmol/L或成人LDL-C＞4.90 mmol/L以及患者或親屬有黃色瘤診斷為 FH。其中，TC＞16.00 mmol/L并有黃色瘤者診斷為純合子FH。2例先證者臨床均符合FH的診斷。

1.2 研究方法

1.2.1 臨床資料收集 所有家系成員進(jìn)行血脂測定、心電圖、超聲心動圖及頸動脈超聲檢查。記錄家系成員的其他臨床資料 (年齡、性別、發(fā)病年齡、病程、家族史及治療情況)?；純杭覍倬炇鹬橥鈺占蚁党蓡T空腹12 h外周血3 ml，乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-Na2)抗凝，血漿用于血脂測定，血細(xì)胞用于DNA提取。

1.2.2 臨床檢查 采用氧化酶法測定血漿中TC、三酰甘油 (TG)水平;磷鎢酸鎂沉淀及酶法測定高密度脂蛋白膽固醇 (HDL-C)水平;免疫沉淀法測定apo-B100水平;LDL-C按 Friedwald公式計算，LDL-C=TC-(HDL-C+TG/5)。對家系中所有成員進(jìn)行生化檢查。

1.2.3 致病基因突變檢測

1.2.3.1 apo-B100基因Q3500R位點(diǎn)的檢測 提取先證者基因組DNA，擴(kuò)增apo-B100基因3500區(qū)域的片斷309 bp。瓊脂糖凝膠電泳鑒定，對鑒定后的PCR產(chǎn)物經(jīng)正反雙向核苷酸序列分析及與正常序列比對，排除由apo-B100基因3500附近位點(diǎn)突變導(dǎo)致的家族性apo-B100缺陷癥 (FDB)。

1.2.3.2 連鎖分析初篩各家系的易患基因 根據(jù)文獻(xiàn)報道，微衛(wèi)星位點(diǎn) D1S417、D1S2797、D1S2890與PCSK9基因連鎖;微衛(wèi)星位點(diǎn)D19S221、D19S394與LDL-R基因連鎖［9］。用微衛(wèi)星短串聯(lián)重復(fù)序列 (STR)擴(kuò)增體系進(jìn)行DNA定量及PCR，PCR后純化，純化后上機(jī)掃描，用GeneMarker讀取峰值，在GeneMarker中導(dǎo)入家系文件，Genehunter軟件和Lingkage軟件處理并計算 LOD值。LOD值 ＞2.00，肯定連鎖;LOD值＜1.00，肯定不連鎖;LOD 值1.00 ～2.00，可能連鎖。

1.2.3.3 核苷酸序列分析 經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定后符合目的片斷長度的PCR產(chǎn)物，送交生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行酶切、膠回收，進(jìn)行核苷酸序列分析。將測序結(jié)果進(jìn)行分析，找出突變位點(diǎn);分析突變引起的氨基酸改變情況;檢索FH突變數(shù)據(jù)庫［10］，如果在已經(jīng)公布的1 741種突變中未見，則認(rèn)為是新的突變位點(diǎn)。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 19.0統(tǒng)計學(xué)軟件進(jìn)行統(tǒng)計處理，計量資料以 (±s)表示，兩組間比較采用t檢驗，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 患兒心電圖及超聲檢查結(jié)果 先癥者1心電圖示左心室肥厚;先癥者2心電圖大致正常 (見圖1)。先證者1超聲心動圖示主動脈瓣反流;先證者2超聲心動圖示左房室瓣反流 (見圖2)。先證者1頸動脈超聲示頸動脈內(nèi)中膜增厚，頸動脈內(nèi)斑塊形成;先證者2頸動脈超聲示頸動脈內(nèi)中膜增厚 (見圖3)。

圖1 先癥者心電圖結(jié)果Figure 1 ECG of probands

圖2 先癥者超聲心動圖結(jié)果Figure 2 UCG of probands

圖3 先癥者頸動脈超聲結(jié)果Figure 3 Carotid artery ultrasound of probands

2.2 血脂檢測結(jié)果 家系1中11例膽固醇增高者TC水平為 (6.98±1.99)mmol/L，24例血脂正常者TC水平為 (3.20±1.02)mmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=7.023，P＜0.001);膽固醇增高者 LDL-C 水平為(3.02±2.26)mmol/L，血脂正常者 LDL-C 水平為(1.98 ±0.93)mmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=3.497，P=0.004)。

家系2中16例膽固醇增高者 TC水平為 (8.12±3.65)mmol/L，32例血脂正常者 TC水平為 (4.37±1.01)mmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=4.355，P=0.001);膽固醇增高者 LDL-C水平為 (5.72±3.92)mmol/L，血脂正常者 LDL-C水平為 (2.72±0.62)mmol/L，差異有統(tǒng)計學(xué)意義 (t=3.293，P=0.005)。

2.3 基因突變檢測結(jié)果

2.3.1 apo-B100基因 Q3500R位點(diǎn)突變結(jié)果 擴(kuò)增apo-B100基因3500附近突變位點(diǎn)的片斷309 bp，瓊脂糖凝膠電泳鑒定 (見圖4)。對鑒定后的PCR產(chǎn)物經(jīng)正反雙向核苷酸序列分析 (見圖5)及與正常序列比對，均未見患兒apo-B100基因Q3500R位點(diǎn)突變，可排除apo-B100基因與LDL-R結(jié)合部位缺陷造成的高膽固醇血癥。

圖4 瓊脂糖凝膠電泳分析apo-B100基因3500附近突變位點(diǎn)的片斷Figure 4 Agarose electrophoresis of fragments of apo-B100 3500 mutation sites

圖5 apo-B100基因第10708核苷酸序列圖Figure 5 The 10708th nucleotide sequence diagram of apo-B100

2.3.2 連鎖分析結(jié)果 先證者1 LDL-R基因的 LOD值均＞2.00，說明該致病基因肯定與LDL-R基因連鎖;而PCSK9基因的LOD值0.01～1.11，說明可能連鎖，但可能性較小。先證者2的LOD值均＜1.00，說明該致病基因與已知突變基因均不連鎖，推測可能存在新的致病基因 (見表1)。

表1 先證者1和先證者2連鎖分析定位候選基因的LOD值Table 1 LOD values of linkaged candidate genes in proband 1 and proband 2

2.3.3 核苷酸序列分析結(jié)果 LDL-R基因和 PCSK9基因的核苷酸序列分析發(fā)現(xiàn)，先證者1 LDL-R基因第2外顯子97位點(diǎn)C＞T雜合終止突變 (見圖6)，AAG TAG對應(yīng)氨基酸由谷氨酰胺變?yōu)榻K止密碼子，為Q12X。Q12X在意大利、法國、土耳其人群中有發(fā)現(xiàn)，但是在中國該突變非常罕見，由于是終止突變，因此也是致病性突變。先證者1暫未發(fā)現(xiàn)PCSK9基因突變。先證者1家系中高脂血癥的直系親屬均進(jìn)行LDL-R基因第2外顯子97位點(diǎn)的測序，結(jié)果在其父親、大姑、四姑和五姑中均發(fā)現(xiàn)Q12X突變，推測先證者1的致病突變基因來自父系親屬的遺傳。先證者2核苷酸序列分析未發(fā)現(xiàn)任何已知突變，推測可能存在第4種新的致病基因。

圖6 先證者1 LDL-R基因第2外顯子核苷酸序列分析結(jié)果Figure 6 Nucleotide sequence analysis results of the second exon of LDL-R gene in proband 1

3 討論

連鎖分析使用基因組中與基因突變部位或緊鄰的多態(tài)性位點(diǎn)作為標(biāo)記，凡帶有該標(biāo)記的成員可能攜帶致病基因，從而做出間接診斷。連鎖分析作為遺傳學(xué)初篩的主要方法，已經(jīng)被美國、丹麥、荷蘭等國家廣泛使用，國外針對FH的主要致病基因，即LDL-R基因以及新發(fā)現(xiàn)的PCSK9基因，采用家系連鎖分析的方法，做了大量研究，既為后期測序工作明確了方向，又節(jié)省了大量的人力物力［11］。

而我國篩選基因突變的方法普遍滯后于國外發(fā)達(dá)國家，有技術(shù)問題，也有經(jīng)費(fèi)問題、成本問題。目前常用的檢測FH基因突變的方法有:(1)點(diǎn)突變的檢測:主要方法有PCR-單鏈構(gòu)象多態(tài)性 (SSCP)和變性高效液相色譜分析 (DHPLC)。SSCP是前幾年常用的檢測FH基因突變的方法，但是SSCP僅對于檢測LDL-R基因突變具有高度敏感性，并且僅對LDL-R基因單個堿基置換和某一片段DNA突變位點(diǎn)的篩查有效，不能檢測到大片段缺失或重排［12］。DHPLC異源雙鏈的形成取決于高效液相色譜的溫度，而色譜溫度的選定與野生型DNA融解溫度有關(guān)，對于溫度的控制有一定難度。而越來越多的文獻(xiàn)已表明，F(xiàn)H是異質(zhì)性疾病，LDL-C僅是其中一個常見突變基因類型［13］，這顯然不適合目前研究現(xiàn)狀。(2)大片段缺失或重排的檢測:主要包括Southern印跡雜交實驗和long-distance PCR。Southern印跡雜交實驗過程復(fù)雜且涉及的試劑也較多，對DNA的質(zhì)量要求較高，否則酶切不完全將導(dǎo)致失敗，總的來說，Southern印跡雜交實驗是一種費(fèi)時費(fèi)力的方法。long-distance PCR改善了Southern印跡雜交實驗的部分缺點(diǎn)，但其缺點(diǎn)為基因缺失必須在擴(kuò)增片斷所需引物的范圍之內(nèi)，否則缺失的等位基因?qū)⒉槐粩U(kuò)增，從而導(dǎo)致分析結(jié)果錯誤地表現(xiàn)為野生型 (正常)。(3)插入突變的檢測:主要采用通用引物熒光定量 PCR(UPQFM-PCR)。但由于其檢測基因的單一性和對產(chǎn)物片斷的選擇性，不提倡將其作為候選基因的初篩方法。(4)拷貝數(shù)的檢測:荷蘭的Eijk-Van Os等［14］所帶領(lǐng)的研發(fā)小組于2002年發(fā)表多重連接探針擴(kuò)增技術(shù)(MLPA)。具有高靈敏度、高特異度、可重復(fù)性、簡單、高流通量、低成本 (指DNA)。其缺點(diǎn)是:比普通的PCR反應(yīng)對雜質(zhì)更敏感 (PCR抑制劑如苯酚殘留物等);自行開發(fā)探針混合物需要花費(fèi)相當(dāng)?shù)臅r間和精力;與熒光原位雜交技術(shù) (FISH)相比，MLPA不能檢測單個細(xì)胞DNA拷貝數(shù)的變化;只能針對單一基因突變，且費(fèi)用較高。

近幾年，基因芯片發(fā)展勢頭十分迅猛，其中一個重要應(yīng)用就是基因突變的檢測。其原理與經(jīng)典的核酸分子雜交方法一致，基因芯片在一微小的基片 (硅片、玻片、塑料片等)表面集成了大量的分子識別探針，能夠在同一時間內(nèi)平行分析大量的基因，進(jìn)行大信息量的篩選與檢測分析。但其存在的缺陷也相當(dāng)明顯。首先是成本問題，由于芯片制作的工藝復(fù)雜，信號檢測也需專門的儀器設(shè)備，一般實驗室難以承擔(dān)其高昂的費(fèi)用;其次在芯片實驗技術(shù)上還有多個環(huán)節(jié)尚待提高，如在探針合成方面，如何進(jìn)一步提高合成效率及芯片的集成程度是研究的焦點(diǎn)。而樣品制備的簡單化與標(biāo)準(zhǔn)化則是芯片應(yīng)用進(jìn)一步普及的前提;再次其操作復(fù)雜，結(jié)果難以分析，極大限制了基因芯片技術(shù)在生命科學(xué)研究領(lǐng)域的應(yīng)用。

以上幾種方法均只能作為基因突變篩查的單一著手點(diǎn)，對于FH這類多種致病基因存在的單基因疾病而言，將連鎖分析作為候選基因初篩的入手點(diǎn)，具有明顯優(yōu)勢。近幾年，連鎖分析選擇的遺傳標(biāo)記迅速發(fā)展，由限制性酶切片斷到微衛(wèi)星［15］。由于易于檢測，遺傳穩(wěn)定性高、重復(fù)性好、省時省力，相比于前幾種基因初篩方法更具廣泛應(yīng)用價值。Damgaard等［16］運(yùn)用最新的微衛(wèi)星位點(diǎn) (D1S2890、D19S221、D19S394)設(shè)計熒光引物，采用新型毛細(xì)管電泳儀，對丹麥20個FH家系共158名成員進(jìn)行微衛(wèi)星連鎖分析，最終發(fā)現(xiàn)多種突變。

本研究所選2個家系均是顯性遺傳，因此銜接子蛋白(adaptor protein ARH)基因、膽固醇7羥化酶(CYP7A1)基因等隱性遺傳的幾種致病基因可以直接排除。針對新發(fā)現(xiàn)的PCSK9基因和主要的致病基因(LDL-R基因)，設(shè)計熒光引物，采用 D1S417、D1S2797、D1S2890、D19S221、D19S394等微衛(wèi)星位點(diǎn)結(jié)合新型毛細(xì)管電泳儀進(jìn)行研究，成功建立了中國漢族FH家系PCSK9基因連鎖分析的微衛(wèi)星連鎖分析條件，并將現(xiàn)有LDL-R基因微衛(wèi)星連鎖分析的條件適當(dāng)改變，建立了應(yīng)用新型毛細(xì)管電泳儀分析微衛(wèi)星峰圖的條件，為后期研究做好了準(zhǔn)備。

本研究成功發(fā)現(xiàn)1例中國罕見突變 Q12X，即LDL-R基因第2外顯子97位點(diǎn)C→T雜合終止突變，氨基酸密碼子由CAG轉(zhuǎn)變?yōu)門AG，編碼的谷氨酰胺轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼子，由于是終止突變，因此也是致病性突變。家系2的測序結(jié)果提示可能存在新的未知的致病基因，本課題組下一步將進(jìn)行全基因組掃描以期發(fā)現(xiàn)新的致病基因。

綜上所述，連鎖分析作為遺傳學(xué)初篩方法之一，可以很好地應(yīng)用于FH的基因初篩，并且成功建立了中國漢族FH家系LDL-R基因和PCSK9基因的連鎖分析條件，對下一步的基礎(chǔ)研究奠定了堅實的基礎(chǔ)。

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