繆菊連，王成軍，劉海周（.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理67000；.云南中醫(yī)學(xué)院，云南昆明65000）

黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的萃取工藝優(yōu)選

繆菊連1，王成軍1，劉海周2
（1.大理學(xué)院藥學(xué)與化學(xué)學(xué)院，云南大理671000；2.云南中醫(yī)學(xué)院，云南昆明650200）

摘要：以超臨界CO2進(jìn)行萃取，采用HPLC法測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，優(yōu)選的萃取條件為壓力30 MPa，溫度45℃，CO2流量20 L/h，夾帶劑為95%乙醇，加入量為藥材重的5%，萃取時(shí)間2 h，粉碎粒度60目，萃取率為0.558 mg/g，結(jié)果顯示超臨界CO2萃取黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷有效可行。

關(guān)鍵詞：黃芪；超臨界CO2；毛蕊異黃酮葡萄糖苷

黃芪為豆科植物蒙古黃芪 Astragalus membranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus（Bge.）Hsiao或膜莢黃芪A.membranaceus（Fisch.）Bge.的干燥根，具有補(bǔ)氣固表、利水退腫、托毒排膿、生肌等功效[1]，黃芪的化學(xué)成分復(fù)雜，主要有皂苷類、黃酮類及其苷類、多糖類、氨基酸類等[2]，毛蕊異黃酮葡萄糖苷是黃酮類中活性教高的一種，有抗病毒、抗菌、降血脂、抗氧自由基、抗缺血和改善血象等作用[3-4]。報(bào)道中主要是黃芪甲苷的提取方法[5-7]，而2010年版藥典中“黃芪”項(xiàng)下增加了毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量控制，毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量低，提取工藝報(bào)道較少，尋求一種高效優(yōu)質(zhì)的提取工藝歷來(lái)是中醫(yī)藥專家們研究點(diǎn)的熱點(diǎn)，超臨界流體特別是超臨界CO2具有無(wú)毒、不燃燒、對(duì)環(huán)境友好、產(chǎn)品質(zhì)量高、提取時(shí)間短，無(wú)溶劑殘留等優(yōu)點(diǎn)，在分析、化工、材料、色譜等方面顯示出廣闊的前景[8-10]。目前，利用超臨界CO2萃取黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖少見(jiàn)報(bào)道，為提高毛蕊異黃酮葡萄糖苷的提取率，現(xiàn)研究利用超臨界CO2提取毛蕊異黃酮葡萄糖苷工藝的可行性及最佳工藝的優(yōu)選，為尋找更好更有效率的毛蕊異黃酮葡萄糖苷提取工藝提供參考。

1　材料與方法

1.1材料

HA221-50-06超臨界萃取裝置：江蘇華安科技有限公司；1100型高效液相色譜儀：美國(guó)Agilent；XS125A型電子天平：上海光學(xué)儀器一廠；RE-52型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：上海博通；SHZ-D循環(huán)水式真空泵：河南鞏義市英峪豫華儀器廠；毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號(hào)：20633-67-4）：中國(guó)食品藥品檢定研究院提供；甲醇為色譜純，乙腈為分析純，提取試劑均為工業(yè)純。黃芪藥材經(jīng)云南中醫(yī)學(xué)院楊樹(shù)德教授鑒定為豆科植物蒙古黃芪Astragalusmembranaceus（Fisch.）Bge.var.mongholicus （Bge.）Hsiao的干燥根。

1.2方法

1.2.1毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量測(cè)定[1]

按2010年版《中國(guó)藥典》一部“黃芪”藥材的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量測(cè)定方法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2樣品的處理

精密吸取黃芪萃取液5 mL回收溶劑至干，殘?jiān)蛹状既芙猓D(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，進(jìn)樣前用0.45 μm的微孔濾膜過(guò)濾，即得可測(cè)定毛蕊異黃酮葡萄糖苷的供試品溶液。

1.2.3超臨界CO2萃取黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷工藝參數(shù)優(yōu)化

用CO2作為萃取劑，從可能影響毛蕊異黃酮葡萄糖苷萃取的萃取壓力、粉碎粒度、萃取溫度、萃取時(shí)間、CO2流量及夾帶劑和夾帶劑的量等進(jìn)行單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)選。萃取方法：稱取一定粉碎度的黃芪藥材適量，裝入萃取釜中，對(duì)萃取釜、解離釜進(jìn)行加熱，當(dāng)達(dá)到所選定的溫度時(shí)，開(kāi)啟CO2瓶，通過(guò)高壓泵對(duì)系統(tǒng)加壓，當(dāng)萃取釜、解離釜壓力分別達(dá)到所設(shè)定的壓力時(shí)，以一定的速度加入夾帶劑，調(diào)節(jié)CO2的流量到一定值，保持恒溫恒壓進(jìn)行萃取，當(dāng)達(dá)到所選定的萃取時(shí)間后，從解離釜出料口出料，收集保存，按“1.2.2樣品處理”后進(jìn)行含量測(cè)定。

2　結(jié)果與分析

2.1對(duì)照品與樣品圖譜

對(duì)照品與樣品圖譜見(jiàn)圖1、圖2。

圖1　對(duì)照品色譜圖Fig.1　HPLC chromatograms of reference substance

圖2　樣品色譜圖Fig.2　HPLC chromatograms of reference sample

2.2夾帶劑的種類優(yōu)選

根據(jù)預(yù)試驗(yàn)，不加入夾帶劑時(shí)幾乎提取不出毛蕊異黃酮葡萄糖苷，只能起到除雜作用，除雜的工藝條件優(yōu)選為萃取壓力為15 MPa，萃取溫度為45℃，萃取0.5 h，CO2流量為10 L/h。據(jù)毛蕊異黃酮葡萄糖苷的理化性質(zhì)及參考文獻(xiàn)，精密稱取黃芪藥材適量除雜后，選擇95%的乙醇、40%乙醇及丙酮為夾帶劑，加入量為藥材量的10%的體積數(shù)（下同），萃取壓力為30MPa，萃取溫度為45℃，萃取2 h，CO2流量為15 L/h進(jìn)行萃取，得到的產(chǎn)品按樣品處理方法進(jìn)行處理，測(cè)定含量，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷提取率分別為0.33、0.17、0.21 mg/g，故選擇95%的乙醇為夾帶劑。

2.3.2夾帶劑量的選擇

精密稱取黃芪藥材適量除雜后，按藥材量的5%、25%、45%分別加入95%乙醇，按萃取壓力為30 MPa，萃取溫度為45℃，萃取2 h，CO2流量為15 L/h進(jìn)行萃取，得到的產(chǎn)品按樣品處理方法進(jìn)行處理，測(cè)定含量，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷提取率分別為0.35、0.36、0.35 mg/g，夾帶劑的用量影響很小，故選擇夾帶劑的量為藥材量的5%。

2.2粉碎粒度[11]

精密稱取分別過(guò)10、20、40、60、80目的黃芪粉末適量除雜后，加入藥材量5%的95%乙醇，按萃取壓力為30 MPa，萃取溫度為45℃，萃取2 h，CO2流量為15 L/h進(jìn)行萃取，得到的產(chǎn)品按樣品處理方法進(jìn)行處理，測(cè)定含量，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷提取率分別為0.15、0.21、0.25、0.36、0.31 mg/g故選擇過(guò)60目篩。

2.3提取時(shí)間

精密稱取過(guò)60目篩的黃芪適量除雜后，加入藥材量5%的95%乙醇，按萃取壓力為30 MPa，萃取溫度為45℃，CO2流量為15 L/h分別提取0.5、1、1.5、2、2.5 h，按上述方法進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果毛蕊異黃酮葡萄糖苷提取率分別為0.08、0.17、0.28、0.40、0.40 mg/g，故選擇提取時(shí)間2.0 h。

2.4毛蕊異黃酮葡萄糖苷提取工藝的優(yōu)選

通過(guò)查閱文獻(xiàn)、單因素試驗(yàn)及毛蕊異黃酮葡萄糖苷的性質(zhì)，設(shè)計(jì)L9（34）優(yōu)選壓力、溫度及流量對(duì)超臨界CO2萃取黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的影響。藥材過(guò)60目篩，夾帶劑為95%乙醇，加入量為藥材重的5%，提取2h，以毛蕊異黃酮葡萄糖苷的提取率為考察指標(biāo)。因素水平見(jiàn)表1，正交試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1　因素水平Table 1　Factors and levels

表2　正交試驗(yàn)結(jié)果Table 2　Result of orthogoncd test

表3　方差分析Table 3　Analysis of variance

由極差R可知，各因素對(duì)黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的萃取率的影響次序?yàn)锳>C>B，較好的萃取方案為A3B2C3，即較佳的萃取工藝為：萃取壓力30 MPa，溫度45℃，二氧化碳流量20 L/h。

2.5工藝驗(yàn)證

取5份黃芪藥材，按上述較佳工藝條件進(jìn)行驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4。

表4　工藝驗(yàn)證試驗(yàn)Table 4　Results of confirmatory experimeint

由表4可知，平均提取率0.558 mg/g，RSD%＝1.50%<5%，平均純度57.4%RSD%＝1.99%<5%說(shuō)明工藝穩(wěn)定。

3　結(jié)論與討論

單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)選得出超臨界CO2萃取黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的最佳條件為壓力30 MPa，溫度45℃，CO2流量20 L/h，夾帶劑為95%乙醇，加入量為藥材重的5%，萃取時(shí)間2 h，粉碎粒度60目，萃取率為0.558 mg/g。

超臨界CO2在較低溫度下進(jìn)行，對(duì)生理活性物質(zhì)破壞較??；而且具有操作簡(jiǎn)單，過(guò)程短，萃取效率高，無(wú)有機(jī)溶劑殘留，不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)。因此，超臨界CO2技術(shù)更符合現(xiàn)代化工業(yè)生產(chǎn)要求。本試驗(yàn)中除雜與提取一體化進(jìn)行，除雜后CO2降壓循環(huán)使用，提高溶劑的利用率，夾帶劑加入量較少（藥材量的5%），常規(guī)提取溶劑加入量至少是藥材的10倍左右，超臨界CO2很少的溶劑加入量即可達(dá)到很好的提取效果，溫度低（45℃）不影響毛蕊異黃酮葡萄糖苷的活性。傳統(tǒng)的黃芪除雜是利用石油醚加熱回流除去[12]，加熱時(shí)間長(zhǎng)，可能會(huì)影響毛蕊異黃酮葡萄糖苷的含量，試驗(yàn)中采用傳統(tǒng)除雜與超臨界除雜進(jìn)行對(duì)比，傳統(tǒng)除雜后超臨界CO2萃取物得率為0.483 mg/g，純度為46%，而用超臨界CO2除雜及萃取后萃取物得率為0.558%，純度為57.4%。超臨界CO2更適合黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷的提取及除雜。

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DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2015.24.015

收稿日期：2013-12-09

基金項(xiàng)目：大理學(xué)院應(yīng)用開(kāi)發(fā)基金項(xiàng)目（KYYY201204）

作者簡(jiǎn)介：繆菊連（1977—），女（漢），副教授，碩士研究生，從事藥物制劑及分析教學(xué)與科研工作。

Optimal Technology of Extraction Calycosin Glucoside from Astragali Radix

MIAO Ju-lian1，WANG Cheng-jun1，LIU Hai-zhou2
（1.Department of Pharmacy and Chemistry，Dali University，Dali 671000，Yunnan，China；2.Yunnan University of Traditional Chinese Medicine，Kunming 650200，Yunnan，China）

Abstract：To investigate the technology condition of calycosin glucoside from astragali radix by supercritical CO2fluid extraction，the content of calycosin glucoside determined by HPLC.The optimum extraction technology was as following：extraction pressure was 30 MPa，extraction temparature was 45℃，CO2flow rate was 20 L/h，useing 95%ethanol as cosolvent，cosolvent was 5%，extraction time was 2 h，the size was 60 mesh，extracting rate of calycosin glucoside was up to 0.558 mg/g，the results showsed that supercritical CO2fluid extraction of calycosin glucoside from astragali radix to be effective.

Key words：astragali radix；superctical CO2fluid extraction；calycosin glucoside