饒力群等

摘要：生物信息學(xué)分析表明：OsBBX30基因啟動子含有與逆境相關(guān)的作用元件HSE.為進一步了解OsBBX30基因在生物體內(nèi)受熱誘導(dǎo)，通過OsBBX30基因克隆構(gòu)建原核表達和實時定量PCR分析，證實OsBBX30基因表達受熱脅迫誘導(dǎo)，能增強大腸桿菌的耐熱能力，為深入了解該家族基因和挖掘水稻耐熱基因奠定基礎(chǔ).

關(guān)鍵詞：克??；水稻BBX基因；熱脅迫；實時定量PCR

中圖分類號：S511 文獻標識碼：A

Abstract：Bioinformatics analysis indicates that the promoter of OsBBX30 contains function element HSE， which is related with adversity. In this study， it is found that OsBBX30 gene expression is induced by heat stress， which enhances the E. coli heat resistant ability through bioinformatics，Gene clone prokaryotic expression and realtime quantitative PCR analysis. The results are helpful in understanding the family genes and rice heat resistant genes.

Key words：clone； OsBBX； heat stress； QPCR

水稻是我國重要糧食作物，高溫是制約水稻生產(chǎn)和產(chǎn)量的重要因素，培育耐熱水稻品種是保證水稻穩(wěn)產(chǎn)的重要手段[1]，而利用基因工程技術(shù)是獲得水稻耐熱新品種的重要途徑[1]，因此篩選和克隆水稻耐熱相關(guān)的基因受到人們關(guān)注.

鋅指蛋白是一類具有手指狀結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，在基因表達、細胞分化、胚胎發(fā)育、增強抗逆性等方面具有重要的調(diào)控作用[2]，對植物的生物發(fā)育和脅迫的響應(yīng)是至關(guān)重要的[3]，在光調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育中也是不可替代的[4-5].BBX是一類含有Bbox結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白，通過生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，在水稻中有30個BBX基因，擬南芥中有32個BBX基因[6-8].其中Bbox家族中有一類只在N端具有多個Bbox結(jié)構(gòu)域，在C端不具有CCT結(jié)構(gòu)的鋅指蛋白，稱為DBB （Double Bbox）蛋白亞族基因.擬南芥DBB亞家族中有8個編碼基因，通過比對發(fā)現(xiàn)水稻中有10個OsDBB同源基因[6].擬南芥中該亞家族基因參與調(diào)控擬南芥光形態(tài)建成、光周期調(diào)控開花時間，花的發(fā)育、耐熱，而在水稻中關(guān)于該亞家族基因的功能還未有報道[7].

本研究對OsDBB亞家族中的OsBBX30進行耐熱相關(guān)的生物信息學(xué)分析和運用實時定量PCR技術(shù)檢測其在不同水稻品種中響應(yīng)熱脅迫的表達特征，并通過構(gòu)建含OsBBX30蛋白的大腸桿菌菌株和分析其對大腸桿菌耐熱能力的影響，明確OsBBX30基因響應(yīng)熱脅迫的表達特征，為深入了解其在生物響應(yīng)熱脅迫信號途徑中的作用奠定基礎(chǔ).

1材料與方法

1.1材料與試劑

1.1.1材料

水稻材料為國家雜交水稻中心提供的水稻品種日本晴（ Oryz asativa L ssp.），9311，N22，種植于湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)人工氣候室，水稻生長至幼穗分化期（6期末7期初），分別以0 h，3 h，6 h和12 h在42 ℃進行熱處理.

1.1.2菌株、質(zhì)粒與試劑

大腸桿菌菌株DH5αpGEMT vector，Taq酶和Marker 以及DNA快速純化回收試劑盒，購于天根生化材料（北京）有限公司，質(zhì)粒PET30a由本實驗室保存所得，DNA限制性內(nèi)切酶，反轉(zhuǎn)錄試劑盒（RevertAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit）購于長沙海洋生物技術(shù)有限公司（Fermentas公司代理）， RNA Simple Total RNA Kit購于北京天根生化科技有限公司，熒光定量PCR試劑盒[UltraSYBR Mixture（with ROX）]購于康為世紀.

1.2方法

1.2.1生物信息學(xué)網(wǎng)站介紹

RMAP（http：//www.ricemap.org/index.jsp）——a newgeneration rice genome browser，即RMAP數(shù)據(jù)庫，該數(shù)據(jù)庫收錄了全稻屬基因組圖譜，且從該網(wǎng)站中可以查找目的基因的全長基因組序列、CDS以及潛在的啟動子序列.

PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）——Cis-Acting Regulatory Element，植物順式作用元件數(shù)據(jù)庫，從該網(wǎng)站中可以分析植物中已知基因的啟動子區(qū)含有的順式作用元件.

String （http：//www.string-db.org/）——functional protein association networks，蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫，通過已知的蛋白序列查找同源蛋白和相互作用分析.

1.2.2生物信息學(xué)分析

通過NCBI（http：//www. ncbi. nlm. nih. gov/）網(wǎng)站搜尋到其核酸序列，再利用Rice-map（http：//www.ricemap.org/index.jsp）對水稻OsBBX30基因的結(jié)構(gòu)特征進行分析，并對其啟動子區(qū)域在PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）網(wǎng)站上進行順式作用元件分析.通過String （http：//www.string-db.org/）網(wǎng)站進行蛋白同源性和相互作用分析，最后在ROAD （http：//ricearray.org/index.shtml）網(wǎng)站對水稻OsBBX30基因進行基因生物芯片分析.

1.2.3載體克隆

采用天根生化科技（北京）有限公司RNA提取試劑盒的方法提取水稻日本晴葉片的RNA.利用GenBank中水稻基因組序列獲得OsBBX30基因的CDS序列，并利用Primer Premier5.0設(shè)計特異的克隆引物：F（5′to3′）： TCCTTGTAGTCCCGCGGATGAGGATCCAGTGCGACG，R（5′to3′）： AGGATCCCGGGTACCTCATCCAAGATCAGAACG AT在正向引物和反向引物的5'分別引入EcoRI 和HindIII酶切位點.50 μL的反應(yīng)體系為：1 μL EasyTaq；5 μL 10*buffer；前后引物各1 μL；5 μL cDNA；33 μL ddH2O；4 μL dNTP；PCR反應(yīng)體系為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，30個循環(huán)；最后72 ℃延伸5 min.PCR產(chǎn)物用質(zhì)量分數(shù)為1%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測.

利用DNA純化試劑盒切膠回收目的片段，將目的片段與T載體鏈接，通過熱激法將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中.37 ℃過夜培養(yǎng)后，挑取單菌落進行PCR，并提取陽性克隆的重組質(zhì)粒進行酶切驗證.陽性克隆由鉑尚生物技術(shù)有限公司測序.

將目的片段從T載體上經(jīng)EcoRI 和HindIII切下回收后，與用內(nèi)切酶EcoRI 和HindIII酶切純化后的PET30a載體，去磷酸化后進行連接，用熱激法轉(zhuǎn)化到大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞中，經(jīng)驗證為重組的表達載體.

1.2.4大腸桿菌耐熱性分析

融合蛋白誘導(dǎo)表達：先挑BL21/30aOsBBX301，2，3單克隆于5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8，然后加6 μL IPTG，23 ℃震蕩培養(yǎng)過夜，離心收集菌體備用.SDSPAGE檢測：配置凝膠質(zhì)量分數(shù)為12.6%的分離膠，在燒杯中依次加入下列試劑：30%丙烯酰胺1.5 mL，pH 8.8，1 mol/L TrisHCl 1.2 5 mL，蒸餾水7.05 mL，10%SDS 100 μL，10%過硫酸100 μL，TEMED 10 μL.將所收集菌體用PBS磷酸緩沖液重懸，超聲波破碎10 min后離心棄上清，加10 μL loading buffer充分混勻后沸水浴10 min，冷卻后上樣.

分別挑BL21/pET30a，BL21/30aOsBBX30單克隆于5 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃震蕩培養(yǎng)至OD600=0.6～0.8；加6 μL IPTG，23 ℃震蕩培養(yǎng)過夜；將培養(yǎng)物置于50 ℃下分別震蕩培養(yǎng)0 h，1 h，1.5 h，2 h，2.5 h和3 h；將菌液稀釋100倍后涂布于LB平板，37 ℃倒置培養(yǎng)過夜；拍照、計數(shù).

1.2.5OsBBX30基因表達水平的定量PCR（qRTPCR） 驗證

水稻幼穗分化至6～7期的整片劍葉進行了42 ℃高溫熱處理0 h，3 h ，6 h，12 h后利用QPCR對OsBBX30基因表達水平進行了驗證.首先，利用Primer Premier 5.0設(shè)計序列特異的QPCR引物（表1），actin為內(nèi)參基因.采用Trizol 法抽提水稻葉片總RNA，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒轉(zhuǎn)錄成cDNA，再利用UltraSYBR Mixture（with ROX）試劑盒配制20 μL體系： 13.2 μL ddH2O，5 μL mix，前后引物各0.4 μL，1 μLcDNA.在ABI7300上進行qRTPCR反應(yīng)，反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性10 min；95 ℃變性15 s，60 ℃退火30 s，72 ℃ 32 s，40個循環(huán).通過溶解曲線來確定QPCR反應(yīng)的特異性.再利用相對定量（2-△△Ct）[8]分析目標基因表達水平的變化[9].

2結(jié)果與分析

2.1芯片數(shù)據(jù)分析

2.1.1啟動子作用元件分析

通過RMAP軟件分析表明水稻基因OsBBX30（LOC_Os12g10660）位于12號染色體中，長度為2537 bp，通過將其啟動子序列放入PLANTCARE里面進行啟動子元件分析.發(fā)現(xiàn)除了含有多個 TATABox 和 CAATBox 等基本轉(zhuǎn)錄元件外，還有多個與逆境相關(guān)的元件.其中高溫響應(yīng)元件有HSE，circadian，Gbox，Skn1_motif，ACE，干旱低溫響應(yīng)元件有 MBS，ARE元件.此外，還含有大量與光響應(yīng)的元件，如 GAmotif，chsCMA1a，ERE，MRE 等.

2.1.2OsBBX30蛋白同源性分析

通過NCBI搜索到OsBBX30的蛋白序列，將其蛋白序列放入STRING網(wǎng)站搜索結(jié)果發(fā)現(xiàn)LOC_Os12g10660在粳稻中發(fā)現(xiàn)的同源性較高的蛋白都為DBB亞家族中的蛋白.在其他物種如水稻秈稻，二穗短柄草，高粱，葡萄，擬南芥，苔蘚，毛果楊這7種（見表2）也發(fā)現(xiàn)同源性較高的蛋白.同時也發(fā)現(xiàn)了10種與OsBBX30蛋白功能協(xié)作的蛋白質(zhì)，其中相互作用最強的3種蛋白質(zhì)都來自粳稻品種（表3）.

2.1.3水稻芯片分析

因為OsBBX30基因中含有HSE元件，因此將其在ROAD網(wǎng)站中進行了分析.在OsBBX30基因響應(yīng)熱脅迫中，結(jié)果表明（圖1（a））OsBBX30基因的2個探針在根部的表達量都較高，經(jīng)過 42 ℃的熱脅迫處理，該基因的表達量升高很多，表明該基因?qū)崦{迫逆境有正響應(yīng)作用.圖1（b）結(jié)果則表明OsBBX30基因的2個探針在秈稻干旱脅迫敏感型和秈稻干旱脅迫耐受型中其表達量都很低.經(jīng)過干旱脅迫后，其表達量上調(diào)明顯，表明該基因在同種材料不同類型中對干旱脅迫起到相同的正調(diào)控作用.

2.2原核表達載體構(gòu)建

為進一步研究水稻OsBBX30基因的功能，本實驗構(gòu)建了一個原核表達載體PET30a，用于體外表達OsBBX鋅指蛋白.以水稻基因組cDNA為模板，PCR擴增得到目的片段（圖2（a））.將該目的片段進行純化回收鏈接到pGEMT上，并轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，獲得帶有目的片段的重組載體.將獲得的重組載體的陽性菌落進行擴大培養(yǎng)，提取質(zhì)粒.經(jīng)過HindⅢ與EcoRⅠ酶切，膠回收，去磷酸化，連接，轉(zhuǎn)化4個步驟將目的片段連接到PET-30a上，獲得重組載體（圖2（b））.

2.3大腸桿菌耐熱性分析

將構(gòu)建好的30aOsBBX30載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，確定誘導(dǎo)條件后批量搖菌，超聲波破碎后離心收集沉淀，加樣品稀釋液后點樣.在電壓150 V下電泳1 h，電泳圖見圖3，圖中Ⅰ為空載未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；Ⅱ為空載經(jīng)IPTG誘導(dǎo)；Ⅲ為30aOsBBX30未經(jīng)IPTG誘導(dǎo)：Ⅳ為30aOsBBX30經(jīng)IPTG誘導(dǎo).由圖3中可發(fā)現(xiàn)，與負對照相比在14～20 KD處出現(xiàn)一條額外條帶，即OsBBX30與His Tag的融合蛋白.

生物信息學(xué)分析表明OsBBX30含有HSE順式作用元件，受高溫誘導(dǎo).本實驗對轉(zhuǎn)入了OsBBX30的大腸桿菌菌株進行了耐熱性分析，熱處理溫度為50 ℃，并以含pET30a空載體的大腸桿菌做負對照，通過MTT法測定大腸桿菌活數(shù)[10]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)含OsBBX30的轉(zhuǎn)基因大腸桿菌的存活率較含pET30a空載體的大腸桿菌有明顯提高.說明OsBBX30融合蛋白可能與細菌耐熱相關(guān)蛋白相互作用，使其對熱脅迫的耐受有所提高（圖4）.

融合蛋白SDSPAGE檢測

2.4水稻熱脅迫分析

為了證實OsBBX30基因在水稻中受熱脅迫誘導(dǎo)，筆者選用日本晴，9311，N22，3種水稻品種在0 h，3 h，6 h，12 h進行42 ℃熱處理，以0 h處理作為對照組，采用熒光定量PCR檢測OsBBX30基因的表達水平，結(jié)果表明（圖5），在不同的水稻品種中，OsBBX30基因表達各異.日本晴品種中OsBBX30基因表達量較低，在12 h處理后，OsBBX30基因的相對表達量又有所增加.9311品種中OsBBX30基因表達量也低，并且其相對表達量降低，而N22品種中，OsBBX30基因表達呈明顯增加，且隨熱處理時間延長，其相對表達量呈現(xiàn)明顯增加趨勢.日本晴為粳稻常規(guī)水稻，9311為秈稻常規(guī)水稻，N22為秈稻耐高溫品種.在上述結(jié)果我們證明了，OsBBX30基因在N22中經(jīng)過熱處理后，影響其表達量，推測OsBBX30為耐熱基因.

3結(jié)論

通過PLANTCARE分析發(fā)現(xiàn)，OsBBX30的啟動子區(qū)域含有多個的逆境響應(yīng)順式作用元件，如HSE，Gbox和ABREs等，結(jié)合芯片分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)OsBBX30的表達受高溫誘導(dǎo).通過實時定量PCR驗證發(fā)現(xiàn)該基因在耐熱水稻品種N22中的表達明顯受熱脅迫誘導(dǎo)，由此表明含有逆境響應(yīng)順式作用元件的啟動子在植物逆境脅迫響應(yīng)過程中可能起到至關(guān)重要的作用.研究發(fā)現(xiàn)，水稻N22品種是最耐熱的秈型常規(guī)稻，其在38 ℃高溫下的生產(chǎn)率仍達到64%～86%[11].9311作為秈型常規(guī)稻，其品質(zhì)優(yōu)、產(chǎn)量高[12-13].日本晴屬粳亞種，對溫度和日照長度無特殊響應(yīng)[14].此外，本研究發(fā)現(xiàn)OsBBX30蛋白提高了大腸桿菌對高溫的耐受性，進一步證明OsBBX30與生物耐受熱脅迫存在聯(lián)系.OsBBX30表達受熱脅迫誘導(dǎo)的特征為深入了解水稻的耐熱分子信號傳導(dǎo)途徑提供了新的思路，為水稻抗逆分子育種提供了新的參考，為全面了解水稻抗逆的分子機制奠定了基礎(chǔ).

參考文獻

[1]申秋碩，陳信波，張先文，等.三個逆境相關(guān)的水稻啟動子克隆與瞬時表達分析[J].中國生物工程雜志，2012，32（ 11） ：29-34.

[2]黎毛毛，廖家槐，張曉寧，等，江西省早稻品種抽穗揚花期耐熱性鑒定評價研究[J]. 植物遺傳資源學(xué)報，2014，15（5） ：919-925.

LI Maomao， LIAO Jiahuai， ZHANG Xiaoning， et al. Evaluationof heat toleranceat the headingflowering stages for earlyseason rice varietiesin jiangxi province[J]. Journal of Plant Genetic Resources，2014，15（5） ：919-925.（In Chinese）

[3]RIECHMANN J L， HEARD J， MARTIN G，et al. Arabidopsis transcription factors： genomewide comparative analysis among eukaryotes [J]. Science， 2000， 290（12）： 2105-2110.

[4]KUMAGAI T，ITO S，NAKAMICHI N，et al. The common function of a novel subfamily of Bbox zinc finger proteins with reference to circadianassociated events in Arabidopsis thaliana[J]. Biosci Biotechnol Biochem， 2008， 72（6）： 1539-1549.

[5]張桂蓮，陳立云，雷東陽，等，水稻耐熱性研究進展[J].雜交水稻，2005，20（ 1） ：1-5.

[6]湯日圣，張大棟，鄭建初，等.高溫對不同水稻品種花粉活力及籽粒結(jié)實的影響[J].江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報，2014，15（5） ：919-925.

TANG Risheng， ZHANG Dadong， ZHENG Jianchu， et al. Effects of high temperature on pollen vitality and seed setting of different rice varieties[J].Jiangsu Agricultuer Sciences，2014，15（5） ：919-925.（In Chinese）

[7]KHANNA R， KRONMILLER B， MASZLE D R， et al. The arabidopsis Bbox zinc finger family[J]. Plant Cell， 2009， 21： 3416-3420.

[8]CHANG C S， LI Y H， CHEN L T， et al. LZF1， a HY5regulated transcript tional factor， functions in Arabidopsis deetiolation[J]. Plant Journal， 2008， 54： 205-219.

[9]申秋碩，陳信波，張先文.三個逆境相關(guān)的水稻啟動子克隆與瞬時表達分析[J].中國生物工程雜志，2012，32（ 11） ：29-34.

[10]高瓊，馬傳鑫，李燕妮，等.MTT法測定大腸桿菌活菌數(shù)實驗研究[J].環(huán)境科學(xué)學(xué)報.2011，31（12）：2642-2650.

GAO Qiong， MA Chuanxin， LI Yanni， et al. Experimental study on the application of MTT colorimetric method in counting live escherichia coli[J]. Acta Scientiae Circumstantiae，2011，31（12）：2642-2650.（In Chinese）

[11]JAGADISH S V K， CRAUFURD P Q，WHEELER T R. Phenotyping parents of mapping populations of rice for heat tolerance during anthesis[J]. Crop Science，2008 48：1140-1146.

[12]呂川根. 江蘇省兩系法雜交稻研究與生產(chǎn)[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報， 2010，26（3）： 649-657.

LV Chuangen. Status and countermeasures for research and production of twoline hybrid rice in Jiangsu province[J]. Jiangsu Journal of Agriculture Sciences，2010，26（3）： 649-657.（In Chinese）

[13]戴正元， 劉廣清， 李愛宏， 等. 兩系雜交稻揚兩優(yōu)6 號的選育及栽培特性研究[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報， 2005，21（11）： 114-116.

DAI Zhengyuan， LIU Guangqing， LI Aihong， et al. Breeding of twoline indica hybrid rice combination， “Yangliangyou 6” and studying on its culture characteristics[J].Chinese Agriculutural Science Bulletin，2005，21（11）： 114-116.（In Chinese）

[14]李傳國， 仲維功， 繆炳良. 優(yōu)質(zhì)雜交秈稻新組合粵優(yōu)938的選育與利用[J]. 雜交水稻， 2001， 16（3）： 9-12.