楊 靜，蔣劍春*，張 飛，張 寧，衛(wèi) 民，趙 劍

(1.中國林業(yè)科學研究院林產化學工業(yè)研究所;生物質化學利用國家工程實驗室;國家林業(yè)局林產化學工程重點開放性實驗室;江蘇省生物質能源與材料重點實驗室，江蘇 南京 210042;2.江蘇警官學院刑事科學技術系，江蘇 南京 210031)

目前氣候變化、環(huán)境危機、能源資源短缺正在引起世界范圍內產業(yè)格局的深刻變革，可再生、無污染的生物質能源已成為當今的研究熱點。而生物煉制技術由于其高效、綠色、低碳、可持續(xù)等特征，已經成為生物質資源化利用的發(fā)展趨勢，并成為世界各國的戰(zhàn)略研究方向［1-3］。生物煉制技術通常將玉米稈、稻稈、麥稈等木質纖維素原料轉化為單糖，進而通過微生物發(fā)酵將單糖轉化為生物基產品。衣康酸學名為甲叉琥珀酸、亞甲基丁二酸［4-5］，是世界上第五大有機酸，并被美國能源部選為12種可從糖平臺技術出發(fā)制備的最具開發(fā)和應用潛力的生物精煉高附加值產品之一。由于分子內存在1個不飽合雙鍵和2個活潑的羧基，衣康酸能夠進行加成、聚合、酯化等多種反應，其中尤其重要的是衣康酸的酯化反應。衣康酸酯類是生產腈綸、樹脂、塑料、橡膠、藥物、表面活性劑、無毒食品包裝材料等的工業(yè)原料，廣泛用于化工行業(yè)［6-7］。衣康酸的生產方法有化學合成法、檸檬酸分解法和微生物發(fā)酵法。其中微生物發(fā)酵法由于原料來源廣泛、成本低、生產條件溫和，是目前國內外生產衣康酸的主要方法［8-9］。在衣康酸的生產過程中，如何快速高效地獲得高產菌株至關重要。目前，衣康酸生產菌種主要有屬于土曲霉群的土曲霉(Aspergillus terreus)和屬于灰綠曲霉群的衣康酸曲霉(A.itaconicus)［10-11］。實際生產中應用最多的是土曲霉，但是A.terreus野生菌株一般產量都很低，因此運用誘變育種的方法來獲得高產菌株的研究日益增加。近年來有研究者認為，對野生型菌株單一誘變因素有時也能取得好的效果，但是利用復合因素誘變效果更好，特別是經過多次誘變后的高產菌株更是如此，可利用復合因素來擴大誘變幅度，提高誘變效果［12］。本研究選擇土曲霉作為出發(fā)菌株，通過紫外線-LiCl、硫酸二乙酯(DES)對其進行復合誘變，以期進一步提高其衣康酸產量，為衣康酸的工業(yè)化發(fā)酵生產提供優(yōu)良菌株。

1 實驗

1.1 菌株

土曲霉(Aspergillus terreus)2433，購自于中國工業(yè)微生物菌種保藏管理中心(CICC)。將購買的土曲霉2433經斜面活化2～3代后，稀釋涂指示劑平板。根據變色圈與菌落直徑比，選取20個單菌落進行斜面培養(yǎng)，并進行搖瓶發(fā)酵產酸實驗，5 d后測定衣康酸產量。其中5株產酸量在15 g/L以上，3號菌產酸量為18.83 g/L，相對較高，此時的殘?zhí)橇繛?8.70 g/L，糖酸轉化率為30.7%。選該菌為誘變篩選的出發(fā)菌株。

1.2 培養(yǎng)基

1.2.1斜面培養(yǎng)基 馬鈴薯汁1.0 L，葡萄糖10.0 g，瓊脂20 g，pH值6.8。其中，馬鈴薯汁制備方法為:馬鈴薯洗凈去皮，稱取200 g，切成小塊，加1 000 mL水煮沸1 h，用雙層紗布濾成清液，加水補足蒸發(fā)而減少的水分。

1.2.2種子培養(yǎng)基 葡萄糖 45 g/L，(NH4)2SO45 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KH2PO41 g/L，FeSO4·7H2O 0.04 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05 g/L，玉米漿1 g/L，定容至1 L，pH 值 3.0 ～3.5。

1.2.3發(fā)酵培養(yǎng)基 葡萄糖 80 g/L，(NH4)2SO45 g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KH2PO41 g/L，FeSO4·7H2O 0.04 g/L，ZnSO4·7H2O 0.05 g/L，玉米漿3 g/L，定容至1 L，pH 值 3.5。

1.2.4指示劑平板培養(yǎng)基 葡萄糖80 g/L，(NH4)2SO45g/L，MgSO4·7H2O 1 g/L，KH2PO41 g/L，玉米漿1 g/L，瓊脂2.0%，0.2%的溴甲酚綠溶液50 mL/L用硫酸調pH值3.5(將0.5 g溴甲酚綠溶于250 mL 20%的乙醇溶液即制成0.2%的溴甲酚綠溶液)。

1.3 誘變

1.3.1單孢子懸液的制備 用無菌水將28℃恒溫培養(yǎng)5 d的斜面孢子洗下，接入種子培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)至孢子剛剛萌發(fā)(約6 h)。放入裝有玻璃珠的三角瓶，加入無菌水，振蕩打碎孢子團塊(15 min)，以脫脂棉過濾，用血球計數法進行孢子計數，將孢子濃度調整為1×106個/mL。

1.3.2紫外線-LiCl復合誘變 吸取單孢子懸浮液5 mL，加入到放于磁力攪拌器上的直徑9 cm的培養(yǎng)皿中，在15 cm的距離下用18 W的紫外燈照射0、50、100、150、200和250 s，邊攪拌邊照射，使孢子均勻的吸收紫外線光波。達到照射時間后，立即蓋上皿蓋，將孢子懸液適當稀釋后涂LiCl平板(指示劑平板培養(yǎng)基另外加質量分數為0.3%的LiCl)，用黑布包好，28℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，并計算致死率。選取致死率為70%～80%的UV誘變劑量，對土曲霉單孢子懸液進行誘變后涂布于LiCl平板，篩選優(yōu)良菌株，進行搖瓶篩選。

1.3.3DES誘變 按照1.3.1節(jié)中所述方法，以0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH值7.2)取代無菌水制備孢子懸液。并用0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH值7.2)分別配置體積分數為0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%的DES溶液。各取以上DES溶液和菌懸液等量加入到無菌試管內混勻，室溫振蕩處理10 min，誘變處理結束后加入0.5 mL 2%Na2S2O3終止反應。將孢子懸液適當稀釋后涂布，28℃恒溫培養(yǎng)3～5 d，并計算致死率。選取致死率為70%～80%的DES誘變劑量，對土曲霉單孢子懸液進行誘變，篩選優(yōu)良菌株，進行搖瓶篩選。

1.4 篩選方法

1.4.1平板篩選 將稀釋后的孢子懸液0.1 mL涂布指示劑平板上，倒置于28℃培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)3～5 d，挑選生長快、產生變色圈與菌落直徑比大的單菌落，進行斜面培養(yǎng)。

1.4.2搖瓶篩選 土曲霉突變菌株經斜面培養(yǎng)后，取一環(huán)接種于種子培養(yǎng)基中(搖瓶容積為100 mL，裝液量為30 mL)，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)48 h。然后按10%的接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基(搖瓶容積為250 mL，裝液量為50 mL)，37℃、200 r/min搖床培養(yǎng)5 d，發(fā)酵結束后測定衣康酸。篩選出產酸較高的突變株，每株接入3個三角瓶中進行搖瓶復篩。并按照下式計算糖酸轉化率。

1.5 突變株的穩(wěn)定性考察

選取產酸量高的突變株進行傳代穩(wěn)定性試驗，連續(xù)傳代5次，測定其產酸能力。

1.6 分析方法

殘余葡萄糖和衣康酸含量用高效液相色譜(HPLC)分析，色譜條件:Agilent 1200 system，Aminex HPX-87H色譜柱，流動相為5 mmol/L的硫酸，流速0.6 mL/min，柱溫55℃，示差檢測器，檢測器溫度30 ℃，進樣量10 μL。

2 結果與討論

2.1 紫外線-LiCl誘變

2.1.1紫外線誘變劑量的確定 將單孢子懸液經紫外燈照射0、50、100、150、200和250 s后，涂0.3%LiCl平板，測定不同誘變時間的致死率，繪制致死率曲線，結果見圖1。

由圖可以看出，在照射強度一定的情況下，紫外線對菌株的致死率與照射時間有關。當照射時間在150～250 s范圍內，土曲霉2433的致死率均大于70%。研究表明，菌株突變率隨著誘變劑量的增大而增高，但達到一定劑量后，再加大劑量反而會使突變率下降。一般認為，致死率在70% ～80%時突變率較高［13］。因此，紫外線誘變時間定為150 s。

2.1.2紫外線-LiCl復合誘變結果 出發(fā)菌株孢子懸液經紫外線誘變150 s后，涂布于含有0.3%LiCl的指示劑平板上，28℃恒溫培養(yǎng)，5 d后從中選出36株變色圈與菌落直徑比較大的菌株，進行搖瓶初篩和復篩實驗，其中6株產酸量有所提高，結果見表1。

圖1 紫外線誘變致死率曲線Fig.1 Lethal-rate curve of UV treatment

表1 紫外線-LiCl復合誘變的搖瓶發(fā)酵結果Table 1 Results of fermentation in shaking flasks bycompound mutation of UV-LiCl

LiCl是一種堿金屬類誘變劑，本身并無誘變作用，但其可以改變細胞膜通透性，通常多作為促進其他誘變劑作用的敏化劑［14］。由表1結果可以看出，菌株At UV-03、At UV-24復篩產酸分別達到30.02和28.11 g/L。較出發(fā)菌株18.83 g/L提高了59.43%和49.28%。且經過多次分離，At UV-03菌株產酸量在30 g/L以上，因此選為下一輪誘變的出發(fā)菌株。

2.2 DES 誘變

2.2.1DES誘變劑量的確定 與物理誘變劑相比，化學誘變劑具有專一性的優(yōu)點，每種誘變劑只會引起基因某一部位的突變，而不會對其它部位造成影響。選取DES作為誘變劑，以0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%不同的劑量進行誘變，繪制致死率曲線，結果見圖2。

由圖2可以看出，隨著DES體積分數的增加，菌種的存活率逐步降低，當DES體積分數為1.5%時，致死率在70%～80%之間，因此選為最適誘變劑量。

2.2.2DES誘變結果 At UV-03菌株經1.5%DES誘變后，涂布指示劑平板上，28℃恒溫培養(yǎng)，選出35株變色圈與菌落直徑比較大的菌株，進行搖瓶初篩和復篩實驗，其中5株產酸量有所提高，結果見表2。

圖2 DES誘變致死率曲線Fig.2 Lethal-rate curve of DES treatment

表2 DES誘變的搖瓶發(fā)酵結果Table 2 Results of fermentation in shaking flasks bycompound mutation of DES

由表2結果可以看出，這5株菌株的產酸量較出發(fā)菌株有很大提高，其中菌株At DES-11復篩產酸達到48.22 g/L，較出發(fā)菌株提高了156.08%，糖酸轉化率為61.82%，較出發(fā)菌株提高了101.36%。這說明所采用的復合誘變方法能顯著提高土曲霉的衣康酸產量。

2.3 突變株At DES-11的穩(wěn)定性考察

為了考察誘變菌株的遺傳穩(wěn)定性，對誘變后的At DES-11進行搖瓶發(fā)酵，連續(xù)培養(yǎng)5代。結果表明，經過連續(xù)傳代培養(yǎng)AtDES-11的產酸量分別為48.22、48.18、48.16、48.08和48.05 g/L。培養(yǎng)5代后，At DES-11菌株產酸量穩(wěn)定在48 g/L左右，觀察菌落及菌絲形態(tài)基本無改變，說明菌株土曲霉At DES-11有較好的遺傳穩(wěn)定性。

3 結論

對土曲霉(Aspergillus terreus)2433出發(fā)菌株進行紫外-LiCl和DES復合誘變，選育衣康酸高產菌株。最后得到一株編號為At DES-11的菌株，產酸量為48.22 g/L，較出發(fā)菌株提高了156.08%;糖酸轉化率為61.82%，較出發(fā)菌株提高了101.36%，且經連續(xù)傳代5次，遺傳穩(wěn)定性良好，產酸量穩(wěn)定在48 g/L左右，菌落及菌絲形態(tài)基本不變。

［1］王久臣，戴林，田宜水，等.中國生物質能產業(yè)發(fā)展現狀及趨勢分析［J］.農業(yè)工程學報，2007，23(9):276-282.

［2］陳雅琳，高吉喜，李詠紅.中國化石能源以生物質能源替代的潛力及環(huán)境效應研究［J］.中國環(huán)境科學，2010，30(10):1425-1431.

［3］KAMM B，KAMM M.Principles of biorefineries［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2004，64(2):137-145.

［4］劉建軍，姜魯燕，李丕武，等.衣康酸的性質、生產及應用［J］.山東科學，2002，15(3):38-42.

［5］楊華.國內外衣康酸生產消費與市場分析［J］.上海化工，2007，32(2):46-48.

［6］WILLKE T H，VORLOP K D.Biotechnological production of itaconic acid［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2001，56(3/4):289-295.

［7］OKABE M，LIES D，KANAMASA S，et al.Biotechnological production of itaconic acid and its biosynthesis in Aspergillus terresu［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2009，84(4):597-606.

［8］LOCKWOOD L B，REEVES M D.Some factors affecting the production of itaconic acid by Aspergillus terrus［J］.Archives of Biochemistry，1945，6(3):455-469.

［9］KUENZ A，GALLENMüLLER Y，WILLKE T，et al.Microbial production of itaconic acid:Developing a stable platform for high product concentrations［J］.Applied Microbiology and Biotechnology，2012，96(5):1209-1216.

［10］PETRUCCIOLI M，PULCI V，FEDERICI F.Itaconic acid production by Aspergillus terreus on raw starchy materials［J］.Letters in Applied Microbiology，1999，28(4):309-312.

［11］張建峰，黃梅花，張巖.紅曲霉紫外誘變選育多糖高產菌株［J］.吉林農業(yè)大學學報，2006，28(1):23-31.

［12］白冬梅.L—乳酸高產菌株的誘變選育及其代謝通量分析［D］.天津:天津大學博士學位論文，2001.

［13］王登宇，臧威，孫劍秋，等.細菌原生質體融合育種技術及其應用進展［J］.中國釀造，2008，7(4):1-6.

［14］王博彥，金其榮.發(fā)酵有機酸生產與應用手冊［M］.1版.北京:中國輕工業(yè)出版社，2000.