李景傳，薛博夫，袁媛，馬墨，朱林，Rebecca Milburn，李樂，胡沛臻，葉菁

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重組人神經(jīng)生長因子rh-β-NGF真核表達載體的構(gòu)建及其在HEK293細胞中的表達

李景傳1，薛博夫2，袁媛1，馬墨2，朱林2，Rebecca Milburn2，李樂1，胡沛臻1，葉菁1

1 第四軍醫(yī)大學基礎(chǔ)部病理教研室，陜西西安 710032 2 深圳市港科深研生物科技有限公司，廣東深圳 518067

李景傳, 薛博夫, 袁媛, 等.重組人神經(jīng)生長因子rh-β-NGF真核表達載體的構(gòu)建及其在HEK293細胞中的表達. 生物工程學報, 2015, 31(3): 411–420.Li JC, Xue BF, Yuan Y, et al. Construction of recombinant human nerve growth factor (rh-β-NGF) eukaryotic vector and its expression in HEK293 cells. Chin J Biotech, 2015, 31(3): 411–420.

為大量制備β-NGF，構(gòu)建了一種穩(wěn)定、高效表達重組人神經(jīng)生長因子(Recombinant human nerve growth factor，rh-β-NGF) 的真核表達載體及含該重組載體的HEK293細胞株。首先，構(gòu)建重組質(zhì)粒pCMV-β-NGF-IRES-dhfr并轉(zhuǎn)染至HEK293細胞系，用MTX加壓篩選和有限稀釋法進行選擇，獲得高效表達rh-β-NGF的單克隆重組細胞株；隨后逐步降低血清培養(yǎng)，最終使細胞株完全適應(yīng)無血清培養(yǎng)基并穩(wěn)定表達rh-β-NGF；SDS-PAGE分析該表達產(chǎn)物，可見相對分子質(zhì)量約13 kDa的條帶，純度大于50％，經(jīng)質(zhì)譜法測定得到其肽圖譜與理論序列完全匹配，接著利用離子交換層析和分子篩層析純化rh-β-NGF；最后進行重組細胞株表達效率和表達穩(wěn)定性檢測，表明重組細胞株可穩(wěn)定、高效表達rh-β-NGF，其分泌效率大于20 pg/(cell?d)，并能誘導(dǎo)PC12細胞的分化，具有良好的生物學活性。

重組，神經(jīng)生長因子，真核載體，HEK293細胞，活性鑒定

神經(jīng)生長因子(NGF) 是神經(jīng)營養(yǎng)因子中最早被發(fā)現(xiàn)、目前研究最為透徹的一種神經(jīng)細胞生長調(diào)節(jié)因子，具有神經(jīng)元營養(yǎng)和促突起生長雙重生物學功能，它對中樞及周圍神經(jīng)元的發(fā)育、分化、生長、再生和功能特性的表達均具有重要的調(diào)控作用[1]。關(guān)于NGF，已有很多的基礎(chǔ)研究和臨床應(yīng)用，旨在應(yīng)用NGF作為保護和治療神經(jīng)系統(tǒng)疾病的高效藥物。而且近年研究認識到NGF并不僅僅局限于中樞以及周圍神經(jīng)系統(tǒng)甚至不僅局限在神經(jīng)細胞水平，還在褥瘡[2]、角膜潰瘍[3]、青光眼[4]和免疫性疾病的治療中發(fā)揮著積極的作用[5]。目前生產(chǎn)NGF的方法主要有兩種[6]：一種是從小鼠頜下腺提取的分子量約為13?14 kDa，沉降系數(shù)為2.5 S的β-NGF，此種方式所獲得的β-NGF具有如下缺點：1) 鼠NGF與人NGF在蛋白序列上有10%的差異[7]，使其具有免疫原性，可能誘發(fā)抗體反應(yīng)，從而降低藥效；2) 具有鼠源病毒交叉感染的安全隱患；3) 生產(chǎn)依賴活體動物。另一種是由原核表達系統(tǒng) () 重組表達制備，此種方式的缺陷是蛋白不能進行翻譯后修飾，所得β-NGF活性明顯低于天然β-NGF[6,8]。因此，開發(fā)一種可穩(wěn)定、高效表達天然活性β-NGF的表達系統(tǒng)具有重要的臨床意義及商業(yè)價值。本實驗在人HEK293細胞中表達重組人β-NGF (Recombinant human β-NGF，rh-β-NGF)，構(gòu)建一種可穩(wěn)定、高效表達天然活性β-NGF的重組表達載體，和基于該重組表達載體的重組真核細胞株，以及基于該重組真核細胞株的生產(chǎn)人β-NGF的方法，為大量制備β-NGF提供了實驗基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料、試劑

人HEK293細胞、PC12細胞購自ATCC細胞庫；pCMV-MCS載體、pIRES2-EGFP質(zhì)粒購自Addgene公司；Trizol試劑盒、MTX、Superscript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶、DNA聚合酶、FreeStyle293培養(yǎng)基購自Invitrogen公司；DNA marker、Ⅰ和Ⅱ剪切酶、HⅠ酶和d Ⅲ酶購自TaKaRa公司；DEME完全培養(yǎng)基、胎牛血清、馬血清購自Gibco公司；蛋白marker購自Thermo Fisher公司；注射用鼠神經(jīng)生長因子購自舒泰神(北京) 生物制藥股份有限公司產(chǎn)品，即蘇肽生；引物合成和基因測序由北京奧科鼎盛生物科技有限公司完成。

1.2 人基因的克隆及pCMV-β-NGF重組載體的構(gòu)建

使用Trizol試劑盒提取人胎盤細胞總RNA，所得總RNA為模板，使用Superscript Ⅲ逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA庫，使用特異性擴增基因全長的引物，在DNA聚合酶的催化下進行PCR擴增；PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸1 min，30個循環(huán)。特異性擴增基因全長的上、下游引物序列如表1所示，引物分別包括了HⅠ和d Ⅲ的酶切位點，上游引物上還設(shè)計了序列 (GCCACCATGG)[9]，并且點突變了基因ATG啟動密碼子后第一個堿基 (T突變成G)；下游引物上包含兩個終止碼 (TGATAA)。收集并純化PCR擴增產(chǎn)物，利用上、下游引物上的酶切位點：HⅠ和d Ⅲ將擴增片段構(gòu)建到pCMV-MCS載體 (包含CMV啟動子和β球蛋白基因內(nèi)含子序列) 上，得到重組質(zhì)粒pCMV-β-NGF，進行酶切電泳及測序分析。

1.3 重組質(zhì)粒pCMV-β-NGF-IRES-dhfr的構(gòu)建

1.3.1 PCR擴增

以pIRES2-EGFP質(zhì)粒為模板，以正向引物 (包含Ⅰ酶切位點) 和反向融合引物 (表1) 為引物進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，68 ℃延伸45 s，30個循環(huán)，得到長度為612 bp的擴增片段IRES，收集并純化。

1.3.2 PCR擴增

以人HEK293細胞總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板，以正向融合引物和反向引物 (包含Ⅱ酶切位點，序列如表1所示) 為引物進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，50 ℃退火30 s，68 ℃延伸45 s，30個循環(huán)。得到長度為592 bp的擴增片段，收集并純化。

表1 PCR引物序列

Restriction site were underlined. F: forward primer; R: reverse primer.

1.3.3 PCR融合擴增

將以上PCR擴增片段和為模板，以正向引物和反向引物進行PCR擴增，PCR反應(yīng)條件為：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，48 ℃退火30 s，68 ℃延伸45 s，5個循環(huán)；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，68 ℃延伸80 s，55個循環(huán)，得到與的融合片段，片段長度為1 170 bp，收集并純化融合片段。

1.3.4構(gòu)建至pCMV-β-NGF

將上述融合片段用Ⅰ和Ⅱ雙酶切，所得酶切產(chǎn)物與經(jīng)Ⅰ和Ⅱ酶切處理的pCMV-β-NGF重組載體連接，即得pCMV-β-NGF-IRES-dhfr重組質(zhì)粒，進行酶切電泳及測序分析。

1.4 β-NGF重組細胞株的構(gòu)建及鑒定

1.4.1 HEK293細胞的轉(zhuǎn)染與穩(wěn)定篩選

使用氯化銫密度梯度離心法純化pCMV-β- NGF-IRES-dhfr質(zhì)粒，備后續(xù)步驟使用。用DEME完全培養(yǎng)基 (含10%小牛血清)，在37 ℃、5% CO2的環(huán)境下培養(yǎng)HEK293細胞至60%單層，用磷酸鈣共沉淀方法轉(zhuǎn)染純化后的pCMV-β-NGF-IRES-dhfr質(zhì)粒至HEK293細胞中；24 h后更換培養(yǎng)基，并加入50 nmol/L的MTX進行篩選。當細胞適應(yīng)選擇壓力后，逐次遞增MTX濃度，依次為100、200、400、800 nmol/L。當細胞適應(yīng)800 nmol/L的MTX后，進一步提升MTX濃度至1 000 nmol/L，并使用有限稀釋法選擇高效表達β-NGF的單克隆細胞株，即為β-NGF重組細胞株。我們通過此方法篩選出10株可穩(wěn)定表達β-NGF的重組細胞株。

1.4.2 重組細胞株無血清培養(yǎng)基適應(yīng)及表達產(chǎn)物的電泳鑒定

重組細胞株通過逐步降低血清培養(yǎng)的方式，使其先適應(yīng)了含1% FBS的DMEM培養(yǎng)基，接著在轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)的方式下，逐步用FreeStyle293無血清培養(yǎng)基替換DMEM培養(yǎng)基，最終完全替換，使其完全適應(yīng)FreeStyle293無血清培養(yǎng)基。收集適量培養(yǎng)基，取樣進行SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色、脫色。

1.4.3 質(zhì)譜鑒定表達產(chǎn)物rh-β-NGF

實驗采用毛細管液相色譜分離-電噴霧離子化-四級桿-飛行時間質(zhì)譜法 (UPLC-ESI-Q-TOF-MS) 對β-NGF進行肽圖譜測定：β-NGF用胰蛋白酶水解后溶于0.1% (/) 甲酸溶液，用反相納升級液相色譜-電噴霧串聯(lián)質(zhì)譜進行分析。采用BEH130毛細管液相色譜，樣品上樣10 μL至富集柱 (180 μm×20 mm, Symmetry C18 trap column) 上，用緩沖液A (即0.1%甲酸水溶液) 以10 μL/min流速脫鹽10 min，在線切換至反相C18分離柱 (75 μm×250 mm)。洗脫梯度為：體積含量為1%?5%的緩沖液B (即含0.1%甲酸的乙腈溶液) 5 min，然后在90 min內(nèi)升高至體積含量為40%的緩沖液B，之后以體積含量為99%的緩沖液B沖洗分離柱15 min，流速為200 nL/min。根據(jù)由胰蛋白酶理論水解位點推斷的β-NGF胰蛋白酶肽圖譜的特征碎片離子數(shù)據(jù)，對所得質(zhì)譜肽圖進行分析。

1.4.4 rh-β-NGF的純化及純化產(chǎn)物的鑒定

收集含rh-β-NGF的培養(yǎng)上清1 200 mL，用0.45 μm濾膜微濾，隨后用超濾膜超濾濃縮約8倍。超濾液上樣于SP Sepharose FF強陽離子層析介質(zhì) (機型：GE Healthcare 的AKTA Purifier 10)，平衡緩沖液是20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.0，洗脫緩沖液是20 mmol/L磷酸鹽緩沖液、1 mol/L NaCl，pH 6.0，流速3 mL/min，用20個柱體積進行0?100%線性洗脫，收集目標峰，無菌分裝。另外，為檢測純化后rh-β-NGF的純度和濃度，取以上小量目標蛋白洗脫峰，上樣于Superdex 75 10/300 GL預(yù)裝柱 (機型：Agilent公司的1260 Infinity LC)，層析緩沖液是20 mmol/L磷酸鹽緩沖液，pH 6.0，流速1 mL/min，收集目標峰。在液相色譜曲線中，根據(jù)各組分的峰面積值計算出rh-β-NGF的純度，采用內(nèi)標對比法測定蛋白的濃度。純化后rh-β-NGF進行SDS-PAGE和考馬斯亮藍染色、脫色。

1.5 PC12誘導(dǎo)法檢測重組細胞株所分泌rh-β-NGF的活性

在37 ℃、5% CO2環(huán)境下用DMEM完全培養(yǎng)基 (含5%胎牛血清，12%馬血清) 培養(yǎng)PC12細胞至90%單層，胰酶消化細胞，并將消化后的細胞按每孔5×105個細胞種植于六孔板中；24 h后，清除所有培養(yǎng)基并于每孔內(nèi)加入2 mL新鮮培養(yǎng)基和系列濃度的rh-β-NGF，rh-β-NGF終濃度為0、10、25、50、100、150 ng/mL，于37 ℃、5% CO2的飽和水汽二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h；以空載體pCMV-MCS轉(zhuǎn)染的HEK293細胞上清組作陰性對照組，以加入相應(yīng)等同終濃度的注射用鼠神經(jīng)生長因子 (蘇肽生) 作陽性對照組，在相差顯微鏡下觀察PC12細胞形態(tài)。

1.6 重組細胞株分泌rh-β-NGF的效率檢測

選出6株穩(wěn)定表達β-NGF的重組細胞株置于裝有低血清培養(yǎng)基 (含1% FBS) 的搖瓶中培養(yǎng)，1?2 d后，離心收集細胞，并用新鮮培養(yǎng)基懸浮，調(diào)整細胞密度為1×106細胞/mL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集培養(yǎng)基，進行SDS-PAGE凝膠電泳，同時進行電泳的還有系列稀釋的BSA標準品，電泳結(jié)束后將凝膠進行考馬斯亮藍染色和脫色。

1.7 重組細胞的細胞系穩(wěn)定性試驗

重組細胞株在無MTX低血清的培養(yǎng)基 (含1% FBS) 中傳代30、40、50次和60次后，各取2×106個細胞種植在60 mm培養(yǎng)皿里，更換新鮮培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)基進行SDS-PAGE凝膠電泳，每泳道上樣15 μL，電泳結(jié)束后用考馬斯亮藍染色和脫色。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組表達質(zhì)粒pCMV-β-NGF的鑒定

重組表達質(zhì)粒pCMV-β-NGF經(jīng)測序分析證實，基因片段已整合重組質(zhì)粒中，含有與GenBank (Accession No. 4803)公開的人基因全長序列完全相同的序列。對pCMV-β-NGF進行酶切鑒定，得到大小為749 bp和4 270 bp的兩條帶，結(jié)果與預(yù)期一致 (圖1)。

2.2 重組表達質(zhì)粒pCMV-β-NGF-IRES-dhfr的鑒定

DNA測序結(jié)果顯示該重組質(zhì)粒包含CMV啟動子、β球蛋白基因內(nèi)含子、基因全長、序列和基因。用Ⅰ和Ⅱ雙酶切對pCMV-β-NGF-IRES-dhfr進行酶切鑒定，得到大小為1 158 bp 和4 942 bp的兩條帶，結(jié)果與預(yù)期一致 (圖2)。

圖1 重組質(zhì)粒pCMV-β-NGF瓊脂糖電泳分析

圖2 重組質(zhì)粒pCMV-β-NGF-IRES-dhfr瓊脂糖電泳分析

2.3 重組細胞株分泌rh-β-NGF的SDS-PAGE鑒定

重組細胞株可以分泌rh-β-NGF到液態(tài)培養(yǎng)基中。我們將一株已適應(yīng)FreeStyle293無血清培養(yǎng)基的β-NGF重組細胞株按1×106/mL的起始密度置于裝有FreeStyle293無血清培養(yǎng)基的搖瓶中連續(xù)培養(yǎng)6 d，期間每天收集適量培養(yǎng)基，并更換新鮮培養(yǎng)基。對第1?6天的取樣結(jié)果進行SDS-PAGE凝膠電泳 (1、2、3、4、5、6分別代表第1、2、3、4、5、6 d所收集的培養(yǎng)基，每個泳道上樣量為15 μL培養(yǎng)基)，以FreeStyle293無血清培養(yǎng)基作陰性對照。經(jīng)考馬斯亮藍染色和脫色 (圖3)，在大約13 kDa的位置處有明顯條帶，純度在50%以上。

2.3.1 rh-β-NGF的質(zhì)譜鑒定結(jié)果

分泌所得rh-β-NGF經(jīng)質(zhì)譜鑒定，有13段與理論序列相匹配的肽段，其中有代表性的6段序列及所處位置如表2所示，部分相應(yīng)質(zhì)譜圖如圖4所示。質(zhì)譜所測得的rh-β-NGF肽段序列與理論基因翻譯蛋白序列相符。

圖3 重組細胞株表達rh-β-NGF的SDS-PAGE分析

表2 與理論序列相匹配的肽段及位置

圖4 重組細胞株所分泌rh-β-NGF的部分質(zhì)譜圖

2.3.2 純化產(chǎn)物的鑒定結(jié)果

純化的rh-β-NGF經(jīng)SDS-PAGE分析，大約13 kDa的位置處有明顯條帶，經(jīng)Quantity One軟件分析，純度在95%以上，與HPLC測純度結(jié)果>91.7%相符 (圖5)。另外，HPLC測蛋白濃度結(jié)果為0.163 mg/mL，與Bradford法測蛋白濃度結(jié)果0.159 mg/mL相符。

2.4 PC12細胞經(jīng)rh-β-NGF誘導(dǎo)得到分化

PC12細胞經(jīng)誘導(dǎo)后成簇生長，細胞有纖維狀突起的細胞簇為陽性細胞簇，所誘導(dǎo)陽性細胞簇的比例反映了β-NGF的活性。與注射用鼠神經(jīng)生長因子 (蘇肽生) 組相似，重組細胞株分泌的rh-β-NGF組可見陽性細胞簇，而陰性對照組則無陽性細胞簇 (圖6)；說明重組細胞株所分泌的β-NGF具有誘導(dǎo)PC12細胞分化的活性。

圖5 純化rh-β-NGF的SDS-PAGE分析

統(tǒng)計不同濃度rh-β-NGF組以及注射用鼠神經(jīng)生長因子 (蘇肽生) 組所誘導(dǎo)的PC12陽性細胞簇數(shù)占總細胞簇數(shù)的百分比，以陽性細胞簇百分比為縱坐標，以β-NGF濃度為橫坐標繪制劑量-反應(yīng)曲線。相同濃度下，重組細胞株所分泌的rh-β-NGF活性與現(xiàn)有注射用鼠神經(jīng)生長因子 (蘇肽生) 的活性相當或更強 (圖7)。

圖6 NGF誘導(dǎo)PC12細胞分化

2.5 重組細胞株高效分泌rh-β-NGF

用Quantity One軟件進行密度掃描檢測13 kDa位置處的條帶光密度，參照BSA標準品的光密度，計算出β-NGF的含量 (圖8)。經(jīng)檢測，6株重組細胞株培養(yǎng)基中的rh-β-NGF含量為50?100 mg/L培養(yǎng)基，計算其表達效率約為20?50 pg/(cell?d)。

圖7 不同濃度rh-β-NGF組和注射用鼠神經(jīng)生長因子 (蘇肽生) 組誘導(dǎo)PC12陽性細胞簇數(shù)的百分比

2.6 重組細胞系經(jīng)多次傳代仍穩(wěn)定表達rh-β-NGF

細胞系經(jīng)歷30、40、50和60次傳代后仍能表達rh-β-NGF (圖9)，且表達效率穩(wěn)定，培養(yǎng)基中β-NGF含量約100 mg/L。

圖8 重組細胞株分泌rh-β-NGF的效率檢測

圖9 重組細胞株分泌rh-β-NGF的穩(wěn)定性檢測

3 討論

NGF包含α、β、γ 3個亞基，活性區(qū)是β亞基，它具有完整的NGF生物學活性，是與BDNF、NT-3和NT-4結(jié)構(gòu)相關(guān)的神經(jīng)營養(yǎng)因子，為含有半胱氨酸結(jié) (Cysteine knot) 的穩(wěn)定二聚體結(jié)構(gòu)家族，由兩個118個氨基酸組成的單鏈通過非共價鍵結(jié)合而成[10]。β-NGF初始翻譯產(chǎn)物由信號肽、前導(dǎo)肽及成熟肽3部分組成，即pre-pro-NGF[11]，其中，信號肽負責新生肽鏈的細胞內(nèi)轉(zhuǎn)運，前導(dǎo)肽能幫助成熟肽形成具有生物學活性的正確構(gòu)象，而成熟肽才是具有生物學活性的肽段[8,12-13]。目前，已經(jīng)有多種采用基因工程方法制備人的NGF，選擇的表達系統(tǒng)主要有大腸桿菌、酵母、哺乳動物細胞及腺病毒等，其中大腸桿菌不具備蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾系統(tǒng)[14]，酵母細胞的蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾方式與高等真核生物差別較大，很難獲得具有較高生物活性的產(chǎn)物[15-16]，而其他表達系統(tǒng)也都有多種明顯的缺陷。

本實驗選擇哺乳動物細胞表達系統(tǒng)，利用基因重組技術(shù)可將表達人NGF的基因片段插入動物細胞系的基因組里，使這些細胞持續(xù)穩(wěn)定高表達人NGF蛋白。真核細胞系統(tǒng)具有高等真核生物完整的蛋白質(zhì)翻譯后加工修飾系統(tǒng)，具備有利于外源基因表達產(chǎn)物二硫鍵形成的細胞環(huán)境，擁有完備的轉(zhuǎn)錄后加工過程, 包括糖基化、羧基化，使表達的外源真核基因產(chǎn)物能夠保持其天然結(jié)構(gòu)及活性[17]，使得基因重組人NGF和人體自身NGF蛋白序列完全一致。此外，本實驗構(gòu)建的重組細胞株是分泌型細胞株，可以高效表達并分泌NGF蛋白到培養(yǎng)基中，此特點將大大降低下游蛋白純化的工藝難度和成本，避免了如細胞破碎等會增加大量宿主細胞雜質(zhì)蛋白和宿主雜質(zhì)DNA等工藝。在無血清培養(yǎng)條件下可以進一步減少外源雜質(zhì)和潛在污染源，簡化純化工藝，提高回收率，并且大大降低純化成本。

本實驗中，我們優(yōu)選地構(gòu)建出的重組表達載體主要由5部分組成：啟動子 (CMV)、β球蛋白基因內(nèi)含子[18-19](簡稱BGI，可增強人基因的轉(zhuǎn)錄效率，還可促進mRNA從細胞核轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng))、人基因、內(nèi)部核糖體進入位點序列[20-21](簡稱，可招募核糖體對mRNA進行翻譯，以此可調(diào)控其下游篩選標記基因的表達) 和篩選標記基因 ()。重組表達載體采用一個啟動子同時誘導(dǎo)基因和篩選標記基因轉(zhuǎn)錄、并使用啟動后者翻譯的方式，使得細胞耐藥性和表達量高度統(tǒng)一[22]。因此，當使用該重組表達載體轉(zhuǎn)染宿主細胞時，篩選出陽性表達細胞株的概率較大，所得重組表達細胞株在篩選條件下可持續(xù)、穩(wěn)定表達β-NGF蛋白，細胞系經(jīng)多次傳代后，仍能高效表達β-NGF蛋白，其分泌效率大于 20 pg/(cell?d)，為大量制備β-NGF提供了實驗基礎(chǔ)，并為進一步可能的臨床應(yīng)用作出了貢獻。

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(本文責編 陳宏宇)

Construction of recombinant human nerve growth factor (rh-β-NGF) eukaryotic vector and its expression in HEK293 cells

Jingchuan Li1, Bofu Xue2, Yuan Yuan1, Mo Ma2, Lin Zhu2, Rebecca Milburn2, Le Li1, Peizhen Hu1, and Jing Ye1

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Human nerve growth factor (NGF) is a nerve cell growth regulation factor, which can provide nutrition for the neurons and promote the neurites outgrowth. In order to produce large-scale recombinant human nerve growth factor (rh-beta-NGF), we constructed a plasmid vector, which can stably express the rh-beta-NGF in the HEK293 cell lines. First, the plasmid of pCMV-beta-NGF-IRES-dhfr was constructed and transformed into HEK293 cells. Then MTX pressurized filter and limiting dilution methods were used to obtain monoclonal HEK293 cell lines. After stepwise reducing serum in culture media, the cells eventually adapted to serum-free medium and secreted rh-beta-NGF. SDS-PAGE analysis revealed that the expression product owned a molecular weight of about 13 kDa and a purity of more than 50%. The peptide mapping sequencing analysis demonstrated the sequences of rh-beta-NGF matched with the theoretical ones. Later we purified this protein by ion exchange and molecular sieve chromatograph. Finally, our experimental results exhibited that the recombinant cell lines can stably express rh-beta-NGF with a high efficiency of more than 20 pg/cell?day. In addition, this protein could successfully induce differentiation of PC12 cells. In summary, our recombinant HEK293 cells can express bio-active rh-beta-NGF with great efficiency and stability, which supply a valid basis to large-scale production of rh-beta-NGF.

recombinant, nerve growth factor (NGF), eukaryotic vectors, HEK293 cells, biological activities identification

May 13, 2014; Accepted:August 11, 2014

Jing Ye. Tel: +86-29-84772257; E-mail: yejing1219@gmail.com

Supported by:National Natural Science Foundation of China (Nos. 81101711, 81101752), National Major Special Program of New Drug Research and Development (No. 2009ZX09102-226).

國家自然科學基金 (Nos. 81101711，81101752)，重大新藥創(chuàng)制科技重大專項 (No. 2009ZX09102-226) 資助。