樊懿萱，張艷麗，王強，任才芳，王鋒

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小梅山豬骨髓間充質(zhì)干細胞基因修飾

樊懿萱，張艷麗，王強，任才芳，王鋒

南京農(nóng)業(yè)大學江蘇省家畜胚胎工程實驗室，江蘇南京 210095

樊懿萱, 張艷麗, 王強, 等. 小梅山豬骨髓間充質(zhì)干細胞Cx43基因修飾. 生物工程學報, 2015, 31(3): 351–360.Fan YX, Zhang YL, Wang Q, et al. Overexpression of connexin 43 in bone marrow mesenchymal stem cells inXiao Meishan swines. Chin J Biotech, 2015, 31(3): 351–360.

通過在小梅山豬骨髓間充質(zhì)干細胞 (BMSCs) 中過表達縫隙連接蛋白43基因 ()，探究對小梅山豬BMSCs增殖及凋亡的影響，為構(gòu)建轉(zhuǎn)基因動物模型奠定基礎(chǔ)。利用分子技術(shù)構(gòu)建真核表達載體p-，Nucleofector TM法轉(zhuǎn)染P3代BMSCs，檢測細胞轉(zhuǎn)染效率，經(jīng)RT-PCR、免疫熒光和Western blotting鑒定Cx43的表達，流式細胞技術(shù)分析BMSCs的增殖能力和凋亡情況。酶切鑒定和測序結(jié)果表明，p-真核表達載體構(gòu)建成功，轉(zhuǎn)染BMSCs后，陽性細胞約占60%。轉(zhuǎn)基因BMSCs中Cx43蛋白表達顯著增加，細胞增殖能力顯著提高、凋亡率顯著下降。結(jié)果表明，在小梅山豬BMSCs中過表達不僅能促進細胞增殖而且抑制其凋亡，為下一步在體研究奠定了基礎(chǔ)。

基因，小梅山豬，真核表達載體，骨髓間充質(zhì)干細胞

心臟病是一種嚴重威脅人類健康的常見病，具有發(fā)病率高、死亡率高等特點，全世界每年死于心臟病的人數(shù)逐年上升。干細胞移植被視為最有希望攻克這一頑疾的非藥物治療方法。臨床和基礎(chǔ)研究證實，干細胞移植可以通過生成心肌細胞、旁分泌、促進血管再生、抑制心肌細胞凋亡等機制顯著改善心臟功能[1-3]。骨髓間充質(zhì)干細胞(Bone mesenchymal stem cells，BMSCs) 是一群存在于骨髓中、具有不斷增殖和自我更新能力的成體干細胞，在一定條件下，可分化為心肌細胞、骨細胞、脂肪細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞等多種細胞類型，且來源豐富，易于獲取，在細胞治療、組織器官移植及基因治療等方面具有重要的意義[4-6]。但是，干細胞移植治療心臟病具有潛在的致心律失常作用，其主要原因是心肌細胞縫隙連接的含量、分布及磷酸化/非磷酸化狀態(tài)出現(xiàn)明顯異常，即縫隙連接的重構(gòu) (Gap junctions remodeling)[7]。成年哺乳動物心室中縫隙連接主要由縫隙連接蛋白43 (Connexins 43，) 構(gòu)成，后者介導了心肌細胞間電和化學信號的傳遞，對心肌細胞生長、分化有重要作用[8]。目前，關(guān)于基因的研究主要集中在小鼠等小動物和人類中[9-10]，國內(nèi)外尚未見對小梅山豬基因的相關(guān)報道。

此外，豬不僅是我國最重要的肉用家畜，同時由于其內(nèi)臟器官的生理功能特征與人類相近，因此更是人類異種器官移植的重要目標動物和理想的人類疾病模型動物[11-12]。小梅山豬是太湖豬的一個著名類型，體型小，身體緊湊細致，具有繁殖力高、適應性強等優(yōu)點，并且表現(xiàn)出長期近交不衰退的優(yōu)勢，隱性不良基因極少，是十分寶貴的資源，已經(jīng)被農(nóng)業(yè)部列入我國地方品種保護名錄。

鑒于此，本研究以小梅山豬BMSCs為細胞模型，擬克隆獲得小梅山豬基因，構(gòu)建小梅山豬基因真核表達載體，轉(zhuǎn)染小梅山豬BMSCs，觀察記錄其表達情況、細胞增殖能力和細胞凋亡率等，從而為下一步的在體研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

載體p-C1和小梅山豬BMSCs為江蘇省家畜胚胎工程實驗室保存。Prime STAR酶、LA酶、pMD19-T載體、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶Ⅰ、限制性內(nèi)切酶RⅠ均購自TaKaRa公司；凝膠回收試劑盒和小量質(zhì)粒提取試劑盒購自Axygen公司；無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自Omega公司。

細胞基本培養(yǎng)基 (L-DMEM)、胎牛血清、胰蛋白酶、谷氨酰胺、雙抗 (青霉素和鏈霉素)、羊抗鼠β-actin抗體均購自Gibco公司；小鼠單克隆抗體Cx43購自Abcam公司；RNA提取試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑和熒光定量PCR試劑購自天根生化科技 (北京) 有限公司；轉(zhuǎn)染試劑盒NucleofectorTM購自Lonza公司；引物合成和基因測序由上海英駿生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 方法

1.2.1基因的擴增

根據(jù)豬基因cDNA編碼區(qū)序列(GenBank登錄號：AJ293888.1) 設計引物 (表1)，并在其上下游引物中引入Ⅰ和RⅠ酶切位點。PCR 擴增目的基因片段，PCR反應條件：94 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，58.8 ℃退火15 s，72 ℃延伸1 min，共30個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.2 pMD-載體構(gòu)建與測序

PCR 產(chǎn)物經(jīng)快速回收，其產(chǎn)物 (目的片段)與pMD19-T載體在SloutionⅠ作用下于16 ℃連接2 h，然后轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，再將菌液均勻涂布于含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平皿上，37 ℃培養(yǎng)過夜。隨機挑取5個大小均勻的白斑菌落，按照質(zhì)粒抽提試劑盒說明書小量提取質(zhì)粒，經(jīng)PCR和Ⅰ/RⅠ雙酶切鑒定，將獲得的陽性克隆質(zhì)粒 (命名為pMD-)送公司測序。用NCBI在線工具Blast對所克隆基因序列與目標序列進行同源性比較分析。

1.2.3 pEGFP-真核表達載體的構(gòu)建

利用Ⅰ和RⅠ限制性內(nèi)切酶酶切位點，分別對質(zhì)粒p-C1和pMD-進行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳，回收質(zhì)粒載體和基因片段，T4 DNA連接酶于22 ℃連接4 h，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌DH5α，經(jīng)含100 μg/mL氨芐青霉素的LB平皿培養(yǎng)篩選克隆、提取質(zhì)粒后，用Ⅰ和RⅠ雙酶切鑒定，再進行測序。測序正確的菌株于37 ℃擴增，利用無內(nèi)毒素質(zhì)粒試劑盒提取表達載體質(zhì)粒，命名為p-(圖1A)，測定其核酸濃度備用。

1.2.4 表達載體轉(zhuǎn)染BMSCs

將小梅山豬BMSCs接種至6孔板中，培養(yǎng)液為含15%胎牛血清，不含青霉素、鏈霉素的L-DMEM。當細胞匯合達80%?90%時，按照Nucleofector TM轉(zhuǎn)染試劑說明書分別轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒p-及空載體p-C1。轉(zhuǎn)染24 h后，將培養(yǎng)液換為含15%胎牛血清和青霉素、鏈霉素各100 U/mL的L-DMEM。轉(zhuǎn)染48 h后，熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況及細胞形態(tài)。并將p-組細胞消化、離心、去上清，PBS重懸，錐蟲藍拒染法計數(shù)活細胞比例，最后流式細胞儀檢測轉(zhuǎn)染效率。

1.2.5 RT-PCR檢測-mRNA的表達

轉(zhuǎn)染48 h后提取各組細胞總RNA，再逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，加入-引物 (在和連接處設計的引物)，小梅山豬引物作為內(nèi)參，進行PCR擴增，引物見表1。反應條件：94 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)；72 ℃總延伸10 min。擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

表1 載體構(gòu)建和陽性細胞鑒定所用引物

圖1 小梅山豬Cx43基因真核表達載體的構(gòu)建

1.2.6 免疫熒光檢測Cx43表達

接種上述兩組細胞于48孔培養(yǎng)板中，待其長滿至50%時，棄去上清液，PBS漂洗，加入4%的多聚甲醛，固定15 min；用PBS洗滌后，用含0.25% Triton-X-100的PBS孵育細胞30 min；去除液體，PBS洗滌；使用含1% BSA的PBST孵育30 min；棄去液體，滴加1∶100稀釋的Cx43 (小鼠單克隆抗體，Abcam)，在濕盒內(nèi) 4 ℃過夜；棄去一抗孵育液，PBS沖洗，按1∶200稀釋加入Alexa Fluor標記的二抗 (山羊抗小鼠IgG抗體，Invitrogen)，室溫下避光孵育1 h；棄去二抗孵育液，避光條件下PBS洗滌后，加DAPI染液孵育1 min，PBS沖洗，倒置顯微鏡觀察、拍照。

1.2.7 Western blotting檢測Cx43蛋白表達

分別取兩組2×106個細胞加入蛋白裂解液充分裂解，測定蛋白濃度，取等量的蛋白，熱變性后進行10% SDS-PAGE。將蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，封閉后加入1∶200 Cx43抗體，洗膜，以Duplin標記的二抗 (1∶1 000) 結(jié)合，顯色，曝光，最后用Odyssey近紅外熒光掃描儀掃描膠片。每組隨機讀取5次灰度分析數(shù)據(jù)，用Adobe Photoshop軟件 (CS 8.0.1) 分析各條帶的凈光密度值。Cx43蛋白的表達為其與相應的Duplin的光密度值的比值。

1.2.8 生長曲線及細胞周期的測定

取生長狀態(tài)良好的第3代細胞，按2×104個/mL的細胞密度分別接種于48孔培養(yǎng)板，兩組細胞每天各取3個孔進行計數(shù)。以細胞數(shù)為縱坐標，培養(yǎng)時間為橫坐標繪制生長曲線。

取第3代各組細胞，調(diào)整細胞密度為5.0×106個/mL，1 500 r/min 離心5 min，棄上清，用PBS洗1次，離心得到細胞團加入1 mL DNA染色液，漩渦混合5?10 s，室溫避光孵育30 min，上流式細胞儀檢測細胞周期。

1.2.9 細胞凋亡的測定

取上述兩組第3代細胞，待細胞密度達80%左右時，收集細胞并調(diào)整其濃度為106個/mL，采用Annexin V/PI染色法流式細胞儀檢測細胞凋亡。

1.2.10 統(tǒng)計分析

2 結(jié)果與分析

2.1 小梅山豬基因cDNA的擴增

擴增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳分析，顯示為單一條帶，大小約為376 bp，與預期大小一致 (圖1B)。將PCR產(chǎn)物連接到pMD19-T載體上，獲得重組質(zhì)粒pMD-。用Ⅰ和RⅠ對其進行雙酶切鑒定，雙酶切后片段大小分別為2 692 bp和376 bp，與預期結(jié)果相符 (圖1C)。

2.2 p-重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

重組質(zhì)粒p-(圖1A) 分別經(jīng)PCR及Ⅰ和RⅠ雙酶切，結(jié)果表明，所插入的基因大小和方向均正確，利用PCR擴增重組質(zhì)?？傻玫?76 bp的特異性目的條帶 (圖1D)；雙酶切后得到4.7 kb和376 bp的條帶 (圖1E)。測序顯示，所構(gòu)建的p-質(zhì)粒序列與GenBank中公布的目標序列一致。證明本研究構(gòu)建的p-重組質(zhì)粒是成功的。

2.3 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小梅山豬BMSCs的效率

將驗證正確的重組質(zhì)粒p-轉(zhuǎn)染小梅山豬BMSCs，轉(zhuǎn)染后48 h，在熒光顯微鏡下可觀察到小梅山豬BMSCs表達綠色熒光蛋白，該蛋白在細胞核和細胞質(zhì)內(nèi)均有表達，呈高豐度的綠色熒光 (圖2A和2B)。流式細胞儀檢測EGFP陽性率為 (63.28±8.5)% (圖2C)。這也進一步驗證了所構(gòu)建表達載體的正確性。

2.4-在mRNA水平上的表達情況

小梅山豬BMSCs轉(zhuǎn)染48 h 后，采用RT-PCR方法對-基因表達情況的檢測結(jié)果 (圖3) 顯示，轉(zhuǎn)染p-后的小梅山豬BMSCs中，能擴增出593 bp的特異性片段，而轉(zhuǎn)空載體p-C1組未擴增出目的片段，說明轉(zhuǎn)染p-之后外源基因可以獲得良好的轉(zhuǎn)錄。

圖2 pEGFP-Cx43質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小梅山豬BMSCs效率檢測

圖3 小梅山豬BMSCs中E-Cx43 mRNA的檢測

2.5 細胞免疫熒光結(jié)果

細胞免疫熒光檢測可見p-組Cx43蛋白表達陽性，細胞內(nèi)可見大量紅色熒光，而對照組為弱陽性，細胞內(nèi)僅有少量紅色熒光。另外，兩組細胞中Cx43蛋白在環(huán)核膜的細胞漿位置表達量較高 (圖4)。

2.6 Western blotting檢測Cx43蛋白表達結(jié)果

提取3組細胞蛋白先后以抗β-actin抗體及抗Cx43抗體進行Western blotting檢測，可見p-組蛋白條帶顏色比BMSCs和p-C1組深 (圖5A)，與免疫熒光結(jié)果一致，說明轉(zhuǎn)染組中Cx43的表達水平明顯增加。灰度分析結(jié)果(圖5B) 顯示，與BMSCs組和p-C1組相比，p-組的蛋白條帶灰度值升高，差異有顯著性意義 (<0.05)。空載體轉(zhuǎn)染組和BMSCs組之間差異無顯著性意義 (>0.05)。

圖4 熒光顯微鏡觀察Cx43的表達情況 (400×)

圖5 各組的Western blotting和灰度值比較結(jié)果

2.7 細胞增殖能力

結(jié)果顯示兩組細胞呈現(xiàn)“潛伏期-對數(shù)生長期-停滯期”的生長模式，與對照組細胞相比較，p-組細胞生長速度明顯增加(圖6A)。

流式細胞儀檢測結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因小梅山豬BMSCs有25.01%處于S+G2期(細胞增殖期)；對照組細胞有23.07%處于S+G2期，表明轉(zhuǎn)基因的小梅山豬BMSCs分裂增殖能力明顯高于對照組 (<0.05；圖6B和表2)。

圖6 細胞增殖能力和細胞凋亡結(jié)果

表2 Cx43基因?qū)MSCs細胞周期和凋亡的影響

a,b within a column, means without a common superscript differ significantly (<0.05).

2.8 細胞凋亡

用Annexin V/PI染色后通過流式細胞儀檢測分析細胞凋亡情況。結(jié)果顯示，p-質(zhì)粒轉(zhuǎn)染小梅山豬BMSCs的凋亡率顯著低于對照組(<0.05；圖6C和表2)。

3 討論

BMSCs具有貼壁生長的特性，在體外易分離和擴增，免疫源性低，且不存在胚胎干細胞所帶來的醫(yī)學倫理問題，在一定的誘導條件下，這類細胞可定向分化為心肌樣細胞等多種細胞類型，還易于外源基因的轉(zhuǎn)入和表達[13]。Orlic等[14]研究發(fā)現(xiàn)骨髓細胞移植到梗死心臟中可以縮小梗死面積、改善心臟功能。因此，BMSCs是目前干細胞治療心臟病研究的一種理想的種子細胞。

基因治療面臨的首要問題是選擇何種載體將目的基因?qū)氚屑毎⑹蛊溆行П磉_[15]。用于基因治療的載體系統(tǒng)可分為病毒性載體和非病毒性載體兩類。病毒介導的基因轉(zhuǎn)染由于潛在的致瘤副作用而難于在人體應用；非病毒載體雖轉(zhuǎn)染效率不高，但轉(zhuǎn)染毒性低，從患者安全性角度考慮，更需要致力于非病毒載體介導的基因修飾。其次，選擇高效的外源基因?qū)爰毎姆椒ㄒ彩窃鰪娀蛑委煹姆椒ㄖ唬浞譃榉€(wěn)定轉(zhuǎn)染和瞬時轉(zhuǎn)染。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs是一種很難轉(zhuǎn)染的細胞，經(jīng)抗性篩選10 d左右，多數(shù)細胞漂浮，貼壁的細胞體積變大，失去成纖維樣外形，呈不規(guī)則狀。且細胞增殖能力降低，不能形成細胞集落，再次消化后存活細胞較少。我們推測其原因為體外培養(yǎng)及藥物篩選導致BMSCs老化，增殖能力降低。為此，本研究利用p-C1真核表達載體瞬時轉(zhuǎn)染小梅山豬BMSCs。

盡管大量研究顯示干細胞移植可以改善心臟功能，但仍存在諸多問題有待解決，如慢性心衰患者施行干細胞移植治療后會出現(xiàn)心源性猝死[16]，其原因為移植的干細胞未能與宿主心肌細胞形成有效的電-機械耦連，即縫隙連接沒有效地發(fā)揮治療作用[17]。Cx43是哺乳動物心室肌細胞縫隙連接的主要蛋白組分，其介導了心肌細胞間電和化學信號的傳遞。研究發(fā)現(xiàn)，移植敲除基因的骨骼肌成肌細胞至心臟病患者，不能與宿主細胞形成電-機械耦聯(lián)，移植后大大增加了室速、室顫的發(fā)生[18]，而移植過表達的骨骼肌成肌細胞可抑制細胞致心律失常[19]。表明Cx43對維持正常心功能起重要的作用。

本研究發(fā)現(xiàn)過表達可促進小梅山豬BMSCs增殖、抑制其凋亡。Waza等[20]發(fā)現(xiàn)抑制心肌細胞Cx43蛋白表達可導致細胞凋亡增加，Goubaeva等[21]發(fā)現(xiàn)心肌細胞線粒體中存在大量Cx43，對維持線粒體膜完整性、細胞活力及其抗凋亡作用有重要影響。與本研究結(jié)果一致。此外，Cx43蛋白僅少量聚集在鄰近細胞接觸的部位，大多數(shù)Cx43表達在BMSCs的環(huán)核膜的細胞漿位置，這與Goubaeva等結(jié)果相符合[21]。

因此，本研究以p-C1載體為基礎(chǔ)構(gòu)建了帶有小梅山豬基因的真核表達載體p-，經(jīng)限制性內(nèi)切酶酶切、菌落PCR和DNA測序進行鑒定表明，p-帶有的基因片段和GenBank中的序列一致，說明構(gòu)建成功；并在體外轉(zhuǎn)染BMSCs，通過觀察綠色熒光蛋白和RT-PCR證實基因成功轉(zhuǎn)染了小梅山豬BMSCs，通過免疫熒光和Western blotting法檢測到蛋白表達明顯增加，并通過流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)過表達不僅促進了小梅山豬BMSCs細胞增殖而且抑制其凋亡，為下一步移植在體研究奠定了基礎(chǔ)。

[1] Taylor J. Boosting acute myocardial infarction treatment with stem cells. Eur Heart J, 2014, 35(16): 1015–1016.

[2] Murry CE, Soonpaa MH, Reinecke H, et al. Haematopoietic stem cells do not transdifferentiate into cardiac myocytes in myocardial infarcts. Nature, 2004, 428(6983): 664–668.

[3] Alvarez-Dolado M, Pardal R, Garcia-Verdugo JM, et al. Fusion of bone-marrow-derived cells with Purkinje neurons, cardiomyocytes and hepatocytes. Nature, 2003, 425(6961): 968–973.

[4] Liu P, Feng Y, Dong C, et al. Administration of BMSCs with muscone in rats with gentamicin-induced AKI improves their therapeutic efficacy. PLoS ONE, 2014, 9(5): e97123.

[5] Zhang Y, Shen W, Hua J, et al. Pancreatic islet-like clusters from bone marrow mesenchymal stem cells of human first-trimester abortus can cure streptozocin-induced mouse diabetes. Rejuvenation Res, 2010, 13(6): 695–706.

[6] Segers VF, Lee RT. Stem-cell therapy for cardiac disease. Nature, 2008, 451(7181): 937–942.

[7] Severs NJ, Bruce AF, Dupont E, et al. Remodelling of gap junctions and connexin expression in diseased myocardium. Cardiovascular Res, 2008, 80(1): 9–19.

[8] Meier C, Rosenkranz K. Cx43 expression and function in the nervous system-implications for stem cell mediated regeneration. Front Physiol, 2014, 5(106): 1–4.

[9] Johnstone SR, Kroncke BM, Straub AC, et al. MAPK phosphorylation of connexin 43 promotes binding of cyclin E and smooth muscle cell proliferation. Circ Res, 2012, 111(2): 201–211.

[10] Giese S, Hossain H, Markmann M, et al. Sertoli-cell-specific knockout of connexin 43 leads to multiple alterations in testicular gene expression in prepubertal mice. Dis Model Mech, 2012, 5(6): 895–913.

[11] Neeb ZP, Edwards JM, Alloosh M, et al. Metabolic syndrome and coronary artery disease in Ossabaw compared with Yucatan swine. Comp Med, 2010, 60(4): 300–315.

[12] Walters EM, Wolf E, Whyte JJ, et al. Completion of the swine genome will simplify the production of swine as a large animal biomedical model. BMC Med Genomics, 2012, 5: 55.

[13] Monaco E, Bionaz M, Rodriguez-Zas S, et al. Transcriptomics comparison between porcine adipose and bone marrow mesenchymal stem cells duringosteogenic and adipogenic differentiation. PLoS ONE, 2012, 7(3): e32481.

[14] Orlic D, Kajstura J, Chimenti S, et al. Bone marrow cells regenerate infarcted myocardium. Nature, 2001, 410(6829): 701–705.

[15] Hackett CS, Geurts AM, Hackett PB. Predicting preferential DNA vector insertion sites: implications for functional genomics and gene therapy. Genome Biol, 2007, 8(Suppl 1): S12.

[16] Perin EC, Geng YJ, Willerson JT. Adult stem cell therapy in perspective. Circulation, 2003, 107(7): 935–938.

[17] Kolanowski TJ, Rozwadowska N, Malcher A, et al.andcharacteristics of connexin 43-modified human skeletal myoblasts as candidates for prospective stem cell therapy for the failing heart. Int J Cardiol, 2014, 173(1): 55–64.

[18] Roell W, Lewalter T, Sasse P, et al. Engraftment of connexin 43-expressing cells prevents post-infarct arrhythmia. Nature, 2007, 450(7171): 819–824.

[19] Wang D, Shen W, Zhang F, et al. Connexin43 promotes survival of mesenchymal stem cells in ischaemic heart. Cell Biol Int, 2010, 34(4): 415–423.

[20] Waza AA, Andrabi K, Hussain MU. Protein kinase C (PKC) mediated interaction between conexin43 (Cx43) and K(ATP) channel subunit (Kir6.1) in cardiomyocyte mitochondria: Implications in cytoprotection against hypoxia induced cell apoptosis. Cell Signal, 2014, 26(9): 1909–1917.

[21] Goubaeva F, Mikami M, Giardina S, et al. Cardiac mitochondrial connexin 43 regulates apoptosis. Biochem Biophys Res Commun, 2007, 352(1): 97–103.

(本文責編 郝麗芳)

Overexpression of connexin 43 in bone marrow mesenchymal stem cells inXiao Meishan swines

Yixuan Fan, Yanli Zhang, Qiang Wang, Caifang Ren, and Feng Wang

Jiangsu Livestock Embryo Engineering Laboratory, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, Jiangsu, China

We studied the function of connexin 43 () gene in Xiao Meishan swine bone marrow mesenchymal stem cells (BMSCs) resulting from overexpression.eukaryotic expression vector (p-) was constructed and transfected into BMSCs by nucleofectorTM, after detecting the transfection efficiency; the expression ofwas verified by RT-PCR, immunofluorescence and western blotting. Furthermore, we detected its cell cycle and apoptosis through flow cytometry. Our results show that p-plasmid was successfully constructed, and green fluorescence in p-transfected BMSCs was highly expressed with 60% transfection efficiency. In transgenic Xiao Meishan swines BMSCs, the expression level of Cx43 mRNA and protein were up-regulated. Meanwhile, the ability of cell proliferation was significantly increased, and the apoptosis rate was significantly reduced. Taken together,overexpression could promote the proliferation of Xiao Meishan swine’s BMSCs and markedly reduce their apoptosis, which provides evidence forresearch.

gene, Xiao Meishan swines, eukaryotic expression vector, bone marrow mesenchymal stem cells

June 18, 2014; Accepted:October 31, 2014

Feng Wang. Tel: +86-25-84395381;Fax: +86-25-84395314; E-mail: caeet@njau.edu.cn

Supported by: National Natural Science Foundation of China (No. 31201802).

國家自然科學基金 (No. 31201802) 資助。