王麗娟 巴音吉力 盧淮武 李晶 林仲秋

臨床研究論著

CRP+1444 C/T基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜癌的相關(guān)性研究

王麗娟 巴音吉力 盧淮武 李晶 林仲秋

目的探討CRP+1444C/T基因多態(tài)性與子宮內(nèi)膜癌(EC)的相關(guān)性。方法選擇203例EC患者(EC組)和同期健康體檢者203名(對照組)，采用聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RELP)方法檢測CRP+1444C/T基因多態(tài)性，并結(jié)合血清超敏CRP(hsCRP)水平及其他臨床資料進(jìn)行分析。結(jié)果EC組的血清hsCRP高于對照組(P<0.05)，2組的CRP+1444C/T基因型和等位基因的分布相近，比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。與子宮內(nèi)膜癌BMI<25 kg/m2(正常)者相比， BMI≥25 kg/m2(超重)者CC基因型及C等位基因頻率較高(P<0.05)；且超重者CC基因型組的hsCRP水平高于CT+TT基因型組(P<0.05)。結(jié)論CRP+1444C/T基因多態(tài)性可能和包括胰島素抵抗以及炎癥因子在內(nèi)的某些機(jī)制共同作用，影響子宮內(nèi)膜癌的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)。

C-反應(yīng)蛋白；基因多態(tài)性；子宮內(nèi)膜癌

子宮內(nèi)膜癌(EC)的發(fā)生、發(fā)展與多種代謝異常有關(guān)，這些代謝異常與炎癥之間關(guān)系密切[1]。CRP是一項(xiàng)敏感的反映機(jī)體炎癥反應(yīng)的標(biāo)志物。目前認(rèn)為，血清CRP水平是由生理因素和遺傳因素相互作用、共同影響的結(jié)果。Carlson等(2005年)報(bào)道，CRP基因變異對血清CRP水平的影響占35%～50%。然而，目前關(guān)于CRP基因多態(tài)性與EC的相關(guān)性研究不多，中國漢族人群的資料更少。因此，本研究旨在探討中國漢族CRP+1444C/T基因多態(tài)性分布及其與EC之間的關(guān)系。

對象與方法

一、研究對象

2011年3月至2014年10月在我院就診的無血緣關(guān)系的203例漢族EC患者(EC組)，其EC均經(jīng)手術(shù)病理活組織檢查(活檢)證實(shí)。以一對一選取年齡相匹配的203名漢族女性健康體檢者為對照組。2組均排除合并其他惡性腫瘤或有家族性腫瘤病史者。

二、方法

1.采血及外周血DNA提取

研究組患者于入院后行體格檢查并于次日清晨采集空腹血進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測，對照組女性的數(shù)據(jù)為體檢時(shí)獲得。抽取入選者外周靜脈血3 ml，以32 g/L檸檬酸鈉抗凝，采用低滲破裂紅細(xì)胞、標(biāo)準(zhǔn)蛋白酶K消化和飽和DNA試劑盒(北京天根公司)抽取外周血白細(xì)胞基因組DNA，-20℃保存。

2.CRP基因多態(tài)性分析

根據(jù)GenBank公布的CRP基因全序列設(shè)計(jì)引物，由Invitrogen生物工程有限公司合成。上游引物：5-AGCTCGTTAACTATGCTGGGGCA-3，下游引物：5-CTTCTCAGCTCTTGCCTTATGAGT-3，擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物為181 bp。PCR反應(yīng)體系為25 μl，包括預(yù)制Taq混和物12.5 μl、Template DNA 1.5 μl、上下游引物各2 μl、滅菌蒸餾水7 μl。PCR反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性40 s，55℃退火40 s，72℃延伸90 s，共35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。取PCR產(chǎn)物5 μl采用1%瓊脂糖凝膠-溴乙錠染色法進(jìn)行電泳，使用UVI自動(dòng)凝膠成像及分析系統(tǒng)觀察擴(kuò)增結(jié)果。

3.PCR產(chǎn)物的限制性酶切

使用限制性內(nèi)切酶HpyCH4Ⅲ對CRP+1444C/T位點(diǎn)的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行酶切。酶切體系為30 μl，包括PCR產(chǎn)物10 μl、HpyCH4Ⅲ內(nèi)切酶1 μl，10倍FastDigest緩沖液2 μl，滅菌蒸餾水17 μl。于37℃孵育1～2 h，取10 μl經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像及分析系統(tǒng)判斷基因型，取部分PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送廣州艾基生物技術(shù)有限公司測序以進(jìn)一步驗(yàn)證。

4.生化指標(biāo)及體檢資料

采用日立7600全自動(dòng)生化分析儀測定甘油三酯、LDL-C、HDL-C、血糖和超敏CRP(hsCRP)。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、EC組與對照組的一般資料及生化指標(biāo)比較

EC組患者的腰圍、BMI、收縮壓、舒張壓、甘油三酯、空腹血糖、hsCRP水平均高于對照組(P均<0.05)，HDL-C水平低于對照組(P<0.05)，見表1。

表1 EC組與對照組的一般資料和代謝特征資料比較

注：1 mm Hg=0.133 kPa

二、CRP基因+1444C/T多態(tài)性檢測及PCR產(chǎn)物測序結(jié)果

PCR擴(kuò)增產(chǎn)物為181bp的特異性片段(圖1)，然后用內(nèi)切酶HpyCH4Ⅲ酶切。本研究檢測到3種基因型(圖2)：TT純合型(156 bp、25 bp)、CT雜合型(181 bp、156 bp和25 bp)和CC純合型(181 bp)。PCR產(chǎn)物經(jīng)測序進(jìn)一步驗(yàn)證成功(圖3)。

圖1 CRP+1444位點(diǎn)PCR擴(kuò)增電泳圖M：DNA標(biāo)記物

三、CRP基因+1444C/T多態(tài)性分布特點(diǎn)及與EC的關(guān)系

圖2 RP+1444位點(diǎn)酶切電泳圖1：CC基因型 2：CT基因型 3：TT基因型 M：DNA標(biāo)記物

圖3 CRP+1444基因部分序列及測序圖箭頭所指該點(diǎn)為C/T雙峰，為CT基因型

CRP+1444C/T基因型頻率分布經(jīng)χ2檢驗(yàn)符合Hardy-Weinberg平衡，具有群體代表性。各基因型在EC組和對照組的分布比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均>0.05)；而TT基因型以及C等位基因頻率在2組間的分布比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。經(jīng)logistic回歸分析，調(diào)整年齡、舒張壓、收縮壓、血糖、甘油三酯、LDL-C和HDL-C等多因素后顯示，CRP+1444 C/T的CC、CT和TT基因型與EC均無關(guān)(P均>0.05)。將EC組按BMI分為BMI<25 kg/m2(正常)組和BMI≥25 kg/m2(超重)組，發(fā)現(xiàn)超重組CC基因型及C等位基因頻率較正常組增高(χ2=4.011，P=0.045)，見表2。

表2 CRP+1444基因多態(tài)性分布

注：Pa表示EC組與對照組比較的P值;Pb表示2組經(jīng)多因素分析校正后的P值；Pc表示EC兩亞組比較的P值

四、CRP基因型與血清hsCRP水平的關(guān)系

EC組及對照組的CRP+1444 CC基因型組hsCRP水平與CT+TT基因型組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.42vs. 3.61，t=0.155，P=0.877；1.94vs. 2.10，t=0.486，P=0.313)。EC的正常組與超重組hsCRP水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.25vs. 3.76，t=0.112，P=0.125)。EC的正常組(BMI<25 kg/m2)CC基因型與CT+TT基因型的hsCRP水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(3.28vs. 3.19，t=0.287，P=0.182)；而在EC的超重組，CC基因型組的hsCRP水平高于CT+TT基因型組(4.05vs. 3.12，t=2.196，P=0.038)。

對照組同樣分為BMI<25 kg/m2的正常組和BMI≥25 kg/m2的超重組，2組的hsCRP水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.89vs. 1.97，t=0.528，P=0.438)。在BMI<25 kg/m2以及BMI≥25 kg/m2的對照組，CC基因型與CC+TT基因型的hsCRP水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(1.93vs. 1.86，t=0.620，P=0.430；2.01vs. 1.92，t=0.910，P=0.340)。EC組的正常亞組hsCRP水平高于對照組的正常亞組(3.26vs. 1.89，t=9.589，P<0.001)。EC的超重亞組(BMI≥25 kg/m2)hsCRP水平高于對照組的超重亞組(3.76vs. 1.97，t=11.25，P<0.001)。

討 論

目前大量研究表明，炎癥在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中發(fā)揮著重要作用[2]。炎癥標(biāo)志物的表達(dá)量隨著疾病嚴(yán)重程度的上升而增加，與相應(yīng)受體結(jié)合后，可激活核因子-κB通路及JAK通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、抗凋亡及促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移。處于慢性炎癥狀態(tài)時(shí)，患者的氧化應(yīng)激水平提高，這也會(huì)為腫瘤提供適宜的微環(huán)境，利于腫瘤生長、轉(zhuǎn)移。

CRP是炎癥、感染和組織損傷急性期反應(yīng)的非特異性標(biāo)志物，是反映機(jī)體炎癥狀態(tài)的一種敏感、可靠的指標(biāo)[3]。CRP基因定位于人類1號染色體q13.2區(qū)域，約跨越1.9 kb，含有2個(gè)外顯子，中間由1個(gè)內(nèi)含子隔開。功能學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，CRP基因啟動(dòng)子-286C>T>A可影響轉(zhuǎn)錄因子的結(jié)合以及調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性，已證實(shí)其為功能性多態(tài)性位點(diǎn)。CRP基因+1444C/T多態(tài)性與-286C>T>A多態(tài)性位點(diǎn)存在強(qiáng)的連鎖不平衡。由此推測，CRP基因+1444C/T這種多態(tài)性變異可能影響轉(zhuǎn)錄的過程，也有可能其本身就影響啟動(dòng)子的活性，從而影響基礎(chǔ)血清CRP水平。但是研究表明，CRP基礎(chǔ)水平與很多因素相關(guān)，如性別、年齡、BMI、血脂、血壓、環(huán)境因素、生活方式、遺傳因素等，在各種因素所導(dǎo)致的個(gè)體CRP水平差異中，遺傳因素所起的作用能夠達(dá)到40%[4]。

目前關(guān)于CRP與EC的相關(guān)研究尚不多，Dossus等[5]研究發(fā)現(xiàn)，CRP明顯升高的肥胖患者，發(fā)生EC的風(fēng)險(xiǎn)增高。既往研究表明，術(shù)前血清hsCRP水平與EC的FIGO分期、是否有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及患者年齡有關(guān)，高FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和年齡大于50歲者術(shù)前血清hsCRP水平明顯增高；且hsCRP和腫瘤分期與EC的無復(fù)發(fā)生存期及總生存期密切相關(guān)，均可作為EC的獨(dú)立預(yù)后因子[6]。

關(guān)于CRP基因多態(tài)性與EC的關(guān)系研究更少。在Wen等[7]的研究中發(fā)現(xiàn)，CRP+1444C/T在中心性肥胖的EC患者中存在基因型的差異，但未就其與EC患者相應(yīng)的CRP濃度進(jìn)行進(jìn)一步的分析。本研究通過對CRP+1444C/T基因多態(tài)性與EC的相關(guān)分析，發(fā)現(xiàn)在EC患者和正常人之間，各基因型及等位基因分布頻率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。多因素分析顯示，CRP+1444各基因型與EC無關(guān)。將EC組根據(jù)BMI分組后，發(fā)現(xiàn)超重組CC基因型頻率較高，但2個(gè)亞組之間血清hsCRP水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。EC的超重亞組(BMI≥25 kg/m2)中，CC基因型組的hsCRP水平高于CT+TT基因型組。對照組不同BMI亞組之間以及同一BMI亞組不同基因型之間的hsCRP水平相近。相同BMI水平的EC組與對照組相比，hsCRP水平均為EC組高于對照組。這說明EC患者處于一種慢性炎癥狀態(tài)，并通過hsCRP水平反映出來，且基因型在一定程度上可以影響血清hsCRP水平。這些與Dossus等[5]研究結(jié)果相一致。

但在Marsik等(2006年)的研究報(bào)道中，攜帶CRP+1444 C等位基因者的基礎(chǔ)血清CRP水平并不高，而IL-6水平較高；靜脈給予2 ng/kg內(nèi)毒素刺激后，表現(xiàn)為TNF-α和IL-6水平明顯增高、體溫上升，究其原因，可能攜帶CC基因型者炎癥反應(yīng)更強(qiáng)烈。筆者既往研究表明，隨著BMI的增加，EC患者代謝綜合征的發(fā)生率從低體重亞組的0增至肥胖亞組的100%，而代謝綜合征是EC發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[8]。肥胖和代謝綜合征共同的通路是胰島素抵抗，根據(jù)上述結(jié)果推測，CRP+1444 CC等位基因可能通過肥胖相關(guān)的炎癥反應(yīng)導(dǎo)致EC的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)增加，但其更深層的機(jī)制需要進(jìn)一步研究。也有不盡一致的研究結(jié)果， Kumurcu-Bayrak等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，在高血壓病患者中，CRP+1444 CT+TT基因型與血清CRP水平升高有關(guān)。在Martinez-Calleja等[10]的研究中發(fā)現(xiàn)，合并肥胖的2型糖尿病患者CRP+1444 TT基因型占優(yōu)勢。肥胖、高血壓病、糖尿病作為EC的3大危險(xiǎn)因素，與CRP+1444的基因多態(tài)性結(jié)果卻不一致，原因可能是EC的發(fā)生是多基因遺傳因素與環(huán)境因素共同作用的結(jié)果，而單一基因、單一位點(diǎn)的作用較弱。

本研究雖然未直接發(fā)現(xiàn)CRP+1444基因多態(tài)性與EC的關(guān)系，但顯示出了不同BMI者有不同的基因多態(tài)性分布，且EC患者超重亞組CC基因型組的hsCRP水平高于CT+TT基因型組。這提示我們CRP基因多態(tài)性可能和其他因素相互作用、相互影響，通過胰島素抵抗和炎癥因子的共同作用影響EC的發(fā)病。

[1]Esser N, Legrand-Poels S, Piette J, Scheen AJ, Paquot N. Inflammation as a link between obesity, metabolic syndrome and type 2 diabetes. Diabetes Res Clin Pract, 2014, 105(2): 141-150.

[2]Baniyash M, Sade-Feldman M, Kanterman J. Chronic inflammation and cancer: suppressing the suppressors. Cancer Immunol Immunother, 2014, 63(1): 11-20.

[3]Rajendran K, Devarajan N, Ganesan M, Ragunathan M. Obesity, Inflammation and Acute Myocardial Infarction-Expression of leptin, IL-6 and high sensitivity-CRP in Chennai based population. Thromb J, 2012,10(1): 13.

[4]M?lk?nen T, Rostila A, Ruotsalainen E, Alanne M, Perola M, J?rvinen A. Genetic polymorphism of the C-reactive protein (CRP) gene and a deep infection focus determine maximal serum CRP level in Staphylococcus aureus bacteremia. Eur J Clin Microbiol Infect Dis,2010, 29(9): 1131-1137.

[5]Dossus L, Rinaldi S, Becker S, Lukanova A, Tjonneland A, Olsen A, Stegger J, Overvad K, Chabbert-Buffet N, Jimenez-Corona A, Clavel-Chapelon F,Rohrmann S, Teucher B, Boeing H, Schütze M, Trichopoulou A, Benetou V, Lagiou P, Palli D, Berrino F, Panico S, Tumino R, Sacerdote C, Redondo ML, Travier N, Sanchez MJ, Altzibar JM, Chirlaque MD, Ardanaz E, Bueno-de-Mesquita HB, van Duijnhoven FJ, Onland-Moret NC, Peeters PH, Hallmans G, Lundin E, Khaw KT, Wareham N, Allen N, Key TJ, Slimani N, Hainaut P, Romaguera D, Norat T, Riboli E, Kaaks R. Obesity, inflammatory markers, and endometrial cancer risk: a prospective case-control study. Endocr Relat Cancer, 2010, 17(4): 1007-1019.

[6]王麗娟, 周暉, 盧淮武, 李晶, 林仲秋. 術(shù)前血清超敏C反應(yīng)蛋白測定對評估子宮內(nèi)膜癌預(yù)后的價(jià)值. 中華醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 91(41): 2927-2930.

[7]Wen W, Cai Q, Xiang YB, Xu WH, Ruan ZX, Cheng J, Zheng W, Shu XO. The modifying effect of C-reactive protein gene polymorphisms on the association between central obesity and endometrial cancer risk. Cancer, 2008, 112(11): 2409-2416.

[8]王麗娟, 汪新妮, 盧淮武, 李晶, 林仲秋. 子宮內(nèi)膜癌患者代謝綜合征及其組分發(fā)病情況. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)科學(xué)版), 2012, 33(6): 813-817,827.

[9]Komurcu-Bayrak E, Erginel-Unaltuna N, Onat A, Ozsait B, Eklund C, Hurme M, Mononen N, Laaksonen R, Hergenc G, Lehtim?ki T. Association of C-reactive protein (CRP) gene allelic variants with serum CRP levels and hypertension in Turkish adults. Atherosclerosis, 2009, 206(2): 474-479.

[10]Martínez-Calleja A, Quiróz-Vargas I, Parra-Rojas I, Muoz-Valle JF, Leyva-Vázquez MA, Fernández-Tilapa G, Vences-Velázquez A, Cruz M, Salazar-Martínez E, Flores-Alfaro E. Haplotypes in the CRP gene associated with increased BMI and levels of CRP in subjects with type 2 diabetes or obesity from Southwestern Mexico. Exp Diabetes Res, 2012, 2012: 982683.

AssociationofC-reactiveproteingene+1444C/Tpolymorphismwithendometrialcancer

WangLijuan,Bayinjili,LuHuaiwu,LiJing,LinZhongqiu.

DepartmentofGynecologicalOncology,SunYat-senMemorialHospitalofSunYat-senUniversity,Guangzhou510120,China

,LinZhongqiu,E-mail:lin-zhongqiu@163.com

ObjectiveTo investigate the potential association between C-reactive protein (CRP) gene +1444 C/T polymorphism and endometrial cancer.MethodsIn this study, 203 patients with endometrial cancer (EC) and 203 healthy controls were enrolled into the EC and control groups. The CRP gene+1444 C/T polymorphism was determined by polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-RFLP). The serum hsCRP levels combined with alternative clinical data were determined for subsequent analysis.ResultsThe serum hsCRP level in the EC group was significantly higher compared with that in the control group (P<0.05). No statistical significance was documented in the frequencies of CC, CT and TT genotypes between two groups (P>0.05). Compared with EC patients with normal BMI (<25 kg/m2), a significantly higher frequency of CC genotype and C allele type was found in those with BMI≥25 kg/m2(P<0.05). In addition, women with CC genotype or C allele type had significantly higher serum hsCRP levels compared with those with CT and TT genotypes or T allele type (bothP<0.05).ConclusionCRP gene +1444 C/T polymorphism, insulin resistance and inflammatory factors may collectively affect the risk of EC.

C-reactive protein; Gene polymorphism; Endometrial cancer

10.3969/g.issn.0253-9802.2015.08.006

廣東省醫(yī)學(xué)科研基金(B2012105)

510120 廣州，中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院婦科腫瘤?？?/p>

，林仲秋， E-mail: lin-zhongqiu@163.com

2015-02-26) (本文編輯：林燕薇)