劉思汝，林 彥，羅建中

(國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心，廣東 湛江 524022)

不同預(yù)處理方法對檸檬桉染色體制片技術(shù)的影響

劉思汝，林 彥，羅建中＊

(國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心，廣東 湛江 524022)

以檸檬桉種子的根尖為研究材料,通過比較了3種濃度的秋水仙素、2 mmol·L-1的8-羥基喹啉、冰水混合物及以不同比例冰水混合物和0.1%的秋水仙素的混合液等預(yù)處理，在多個時間梯度對檸檬桉根尖染色體制片的影響進(jìn)行了研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：3種濃度秋水仙素預(yù)處理中，0.1%秋水仙素預(yù)處理1.5 h的染色體濃縮適中，分散性好，有較多的分裂相；2 mmol·L-1的8-羥基喹啉預(yù)處理的染色體均分散性較差，且分裂相較少；冰水混合物預(yù)處理12 h的染色體濃縮適中且分裂相較多，分散程度較好。其余處理時間的染色體濃縮程度不理想，不易進(jìn)行染色體分析；混合液中2:3比例下的染色體分散性較好，且濃縮程度適中，有較多的分裂相，綜合比較結(jié)果由優(yōu)到劣的處理方法為：0.1%秋水仙素預(yù)處理1.5 h＞2:3混合液＞冰水混合物處理12 h＞2 mmol·L-1的8-羥基喹啉，其中在上午11:30—12:30取材，0.1%的秋水仙素處理根尖1.5 h，效果最佳。

檸檬桉；預(yù)處理；染色體

植物細(xì)胞的染色體制片是植物細(xì)胞學(xué)、植物分類學(xué)和植物細(xì)胞遺傳學(xué)等學(xué)科不可缺少的技術(shù)，并廣泛應(yīng)用于植物的種質(zhì)資源親緣關(guān)系鑒定、遺傳育種等方面[1]。常見的植物細(xì)胞染色體制片方法包括常規(guī)壓片法[2]、去壁低滲法[3-4]和孚爾根(Feulgen)核反應(yīng)染色法[5]。

桉樹是桃金娘科(Myrtaceae)桉屬(Eucalyptus)、傘房屬(Corymbia)和杯果木屬(Angophora)植物的統(tǒng)稱，也是世界上三大速生樹種之一[6]。桉樹多數(shù)種自然分布于澳大利亞，只有少數(shù)幾個種自然分布于印度尼西亞、巴布亞新幾內(nèi)亞和菲律賓地區(qū)。桉樹種質(zhì)資源豐富，迄今已發(fā)現(xiàn)900多種[7]。我國自1890年引種桉樹以來，經(jīng)過120多年的發(fā)展，特別是近幾十年來的林業(yè)發(fā)展，桉樹已在廣東、廣西、福建、云南、四川等地廣泛種植[8]。桉樹染色體數(shù)為 2 n=22[9]。目前對桉樹屬的染色體數(shù)目和形態(tài)學(xué)知之甚少，由于桉樹的染色體較小，難以辨別桉樹屬的染色體數(shù)目和形態(tài)學(xué)，因而無法準(zhǔn)確地進(jìn)行染色體配對。為了能夠更好地觀察染色體和染色體計數(shù)，獲得較多的中期分裂相，桉樹根尖之前需選擇合適的預(yù)處理劑以及選擇適宜的條件來固定。本試驗以檸檬桉(C. citrodora)根尖為材料，研究了不同預(yù)處理劑和預(yù)處理劑處理的時間2個因素對桉樹染色體制片的影響，旨在為進(jìn)行桉樹選育種提供細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)以及技術(shù)支撐。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

選用檸檬桉為材料，材料取自國家林業(yè)局桉樹研究開發(fā)中心。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料處理

取一層濾紙平鋪于培養(yǎng)皿中，把消毒后的檸檬桉種子均勻地放在濾紙上，每個培養(yǎng)皿中約20粒種子，加入適量的蒸餾水，28℃恒溫箱黑暗培養(yǎng)3 ～ 4 d，待種子根尖長至0.5 ～ 1.5 cm，切取根尖進(jìn)行離體處理。

1.2.2 桉樹根尖細(xì)胞染色體制片

1.2.2.1 取材部位和取材時間

取材部位必須是植物生長活躍，分裂旺盛的部位[10]，一般是根尖的生長點。植物不同取材時間也有所差異，大多數(shù)植物的取材時間在早上9:00—10:00[12]，經(jīng)過試驗結(jié)果表明桉樹宜在上午 11:30—12:30取材，此時間段具有最多處于中期分裂相細(xì)胞。

1.2.2.2 預(yù)處理試驗設(shè)計

以秋水仙素、8-羥基喹啉、冰水混合物以及冰水混合物和 0.1%的秋水仙素混合分別作為預(yù)處理劑用于桉樹根尖固定處理，每個處理方法分別采用5個桉樹種子萌芽的根尖用于染色體制片的比較。(1)分別用0.05%、0.1%、0.2%濃度的秋水仙素處理桉樹根尖1、1.5、2、3 h；(2)用2 mmol·L-1的8-羥基喹啉溶液在 8℃溫度下分別處理 3、4、5 h；(3)用冰水混合物分別預(yù)處理3、6、10、12、18、24 h；(4)冰水混合物和0.1%的秋水仙素按體積比以1:1、2:3、3:2的比例混合處理2 h。

1.2.2.3 材料固定

使用Carnoy固定劑(V冰醋酸：V無水乙醇=1:3)在4℃溫度下固定18 h。

1.2.2.4 解離

將固定好的材料用超純水沖洗 30 min，每 10 min沖洗1次，然后材料在1 mol·L-1的鹽酸60℃的水浴鍋中解離11 min。

1.2.2.5 染色

用蒸餾水將桉樹根尖沖洗干凈，改良的石碳酸品紅染色液染色20 m in左右。

1.2.2.6 壓片及鏡檢

將處理好的材料置于載玻片上，滴加染色液，輕輕蓋上蓋玻片，防止氣泡產(chǎn)生，待充分染色后，用鉛筆輕輕敲打蓋玻片，使材料充分分散均勻，然后使用Olympus BX53的顯微鏡在目鏡10×和物鏡100×油鏡下顯微照相。

1.2.3 試驗結(jié)果評價

試驗中每個處理方法分別取5株檸檬桉根尖用于染色體制片觀察的比較，根據(jù)分裂時期染色體濃縮的長度、數(shù)目以及分散程度作為形態(tài)指標(biāo)。

2 結(jié)果和分析

2.1 3種濃度梯度下的秋水仙素不同預(yù)處理時間下的染色體形態(tài)

利用濃度為0.05%秋水仙素分別處理1、1.5和2 h，由圖1觀察顯示：預(yù)處理1 h的桉樹根尖染色體分散程度一般，有較多分裂前期的染色體且部分染色體重疊、粘連；處理1 h的根尖染色體粘連、重疊現(xiàn)象嚴(yán)重；預(yù)處理2 h的桉樹根尖雖然有較多的染色體分裂相，但是染色體濃縮過短，有成團(tuán)現(xiàn)象。

圖2是經(jīng)過0.1%的秋水仙素預(yù)處理1、1.5、2 h后的觀察結(jié)果。由圖2可知，處理1 h的染色體分散性好，但是染色體濃縮過短；處理1.5 h，細(xì)胞分裂相較多，染色體長度適中，分散性較好；處理2 h的染色體分裂相不多且分散性差，濃縮成團(tuán)，完全觀察不到染色體的形態(tài)特征。

經(jīng)過0.2%秋水仙素分別處理1、1.5、2 h如圖3發(fā)現(xiàn)：預(yù)處理1 h和1.5 h的均有較多的染色體分裂相，但染色體濃縮過短，且分散性極差，不適合桉樹染色體微結(jié)構(gòu)的分析；預(yù)處理2 h染色體分裂相較多，且分散性較好。

2.2 8-羥基喹啉不同預(yù)處理時間下的染色體形態(tài)

圖4是經(jīng)過8-羥基喹啉預(yù)處理3、4、5 h的桉樹根尖材料，中期分裂相較少，而且染色體不易分散。其中預(yù)處理3 h的根尖染色體分散程度較低；處理4 h的根尖染色體細(xì)長，容易發(fā)生較多的粘連、重疊現(xiàn)象，無法觀察到染色體的形態(tài)特征；處理5 h的根尖染色體分裂相較少，且不易分散。

2.3 冰水混合物不同預(yù)處理時間下的染色體形態(tài)

經(jīng)冰水混合物預(yù)處理的根尖結(jié)果如圖5顯示：預(yù)處理3、6、10 h的中期分裂相較少，分裂后期的染色體較多，且染色體細(xì)長，難以用于計數(shù)和染色體核型分析；預(yù)處理12 h的根尖，染色體濃縮適中，可以觀察到較多的分裂相，但效果不如0.1%濃度秋水仙素處理1.5 h(圖2)；處理18 h和24 h的染色體分裂相較少，染色體分散性較好，比較適用于進(jìn)行染色體計數(shù)的研究，但是染色體濃縮過短，染色體之間的大小差異被進(jìn)一步縮小，無法到觀察染色體的形態(tài)。

2.4 冰水混合物和 0.1%的秋水仙素不同比例混合處理2 h下的染色體形態(tài)

冰水混合物與0.1%秋水仙素分別以2:3、3:2、1:1的體積比混合預(yù)處理桉樹根尖，結(jié)果顯示(圖6)：以比例為2:3混合預(yù)處理的染色體分散性較好，且濃縮程度適中，有較多的分裂相，總體效果較冰水混合物處理12 h好，但差于0.1%濃度秋水仙素處理1.5 h(圖2)；以比例為3:2混合預(yù)處理的染色體分散程度較差，且分裂中期的染色體較少；以比例為1:1混合預(yù)處理的根尖染色體較為細(xì)長導(dǎo)致不易分散，且染色體不在同一平面上，拍攝時無法清晰拍攝到每一條染色體，不適合觀察染色體的細(xì)微形態(tài)。

3 結(jié)論與討論

研究植物染色體的核型分析關(guān)鍵是獲得較多分裂中期的染色體，而能有效地把處在有絲分裂中的細(xì)胞停留在早中期的關(guān)鍵是預(yù)處理劑的選擇[12]，因此制片成功與否很大程度上取決于預(yù)處理的好壞[13]。不同的植物，染色體的大小有所不同，因而對預(yù)處理劑的選擇也有所差異，鵝掌楸(Liriodendron chinensis)體胚苗根尖染色體制片中采用環(huán)己酰胺和 0.2%秋水仙素作為預(yù)處理劑能夠獲得較好的染色體形態(tài)[14]。而高山榕(Ficus altissima)在預(yù)處理劑2 mmol·L-18-羥基喹啉和0.05%秋水仙素以1:1的體積比混合液效果最好[15]。本試驗中檸檬桉在處理劑0.1%秋水仙素下能夠取得最好的染色體形態(tài)，與王以紅等[16]對巨尾桉(E. grandis × E. urophylla)廣林9號和尾葉桉(E. urophylla) 4號與處理劑的選擇上有著較大的區(qū)別，造成以上結(jié)論差異的原因可能是試驗材料的差異造成的。

預(yù)處理時間對材料的染色體形態(tài)也有著不可忽視的影響。預(yù)處理時間過短，分裂相較少，且容易導(dǎo)致染色體細(xì)長，易發(fā)生粘連，無法進(jìn)行染色體計數(shù)和研究；而預(yù)處理過長，容易導(dǎo)致染色體濃縮過短，不適合觀察染色體形態(tài)。張健等[17]對木薯(Manihot esculenta)葉片染色體制片技術(shù)中4種預(yù)處理劑不同預(yù)處理時間中均得出 2 h(過短)預(yù)處理時間染色體濃縮程度不足、細(xì)胞分散差，3 h(適宜)染色體濃縮適中，形態(tài)清晰，而4 h(過長)染色體過度濃縮，形態(tài)模糊的結(jié)論。本試驗結(jié)果表明：檸檬桉染色體在0.1%秋水仙素預(yù)處理1.5 h，細(xì)胞分裂相較多，染色體濃縮程度適中，分散性較好。這與王以紅等[16]對巨尾桉廣林9號和尾葉桉4號的預(yù)處理時間也有很大差異，這可能與預(yù)處理劑選擇和實驗材料的不同有關(guān)。

另外，在試驗中除了要考慮預(yù)處理的因素，還要注意在解離后對桉樹根尖充分沖洗干凈，若材料沖洗不干凈，會使根尖不易著色，并且再用鉛筆敲打蓋玻片時，用力要適當(dāng)，用力過猛會敲碎蓋玻片，用力太小桉樹根尖細(xì)胞染色體不易分散開，無法進(jìn)行細(xì)微的觀察。

本試驗僅研究了不同預(yù)處理對檸檬桉根尖染色體制片技術(shù)的影響，對于檸檬桉染色體的更深領(lǐng)域，還有待于進(jìn)一步研究。

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Effect of Different Pretreatment M ethods of Corymbia citriodora Chromosome Technology

LIU Si-ru, LIN Yan, LUO Jian-zhong
(China Eucalypt Research Centre, Zhanjiang 524022, Guangdong, China)

Colchicine, 8?hydroxyquinoline, ice-water mixture, and a mixture of cold water and colchicine (0.1%) were used as pretreatment reagents for Corymbia citriodora root tips for varying durations. The root tips were obtained from new seed germinants. Metaphase chromosomes numbers obtained were highest and chromosome separation was best w ith the pretreatment of 0.1% colchicine for 1.5 h. Relatively few metaphase chromosomes were obtained these showed poor separation for root tips pretreated w ith 2 mmol·L-18-hydroxyquinoline. The pretreatment involving ice-water mixture for 12 h resulted in higher numbers of metaphase chromosomes and better spread of these than the latter treatment, along w ith moderate chromosome condensation. The numbers of metaphase chromosomes appeared higher and good chromosome separation was also obtained when the root tips were treated w ith proportion of ice water and 0.1% colchicine mixed at a ratio of 2:3, and chromosome length was moderate. Based on a comprehensive comparison, the root tip pretreatment methods in order of decreasing effectiveness were: 0.1% colchicine ＞ 2:3 m ixture ＞ice-water ＞ 2 mmol·L-18-hydroxyquinoline. It was also found that the optimal sampling time for taking root-tips was about 11:30 am ? 12:30 pm when using the best pretreatment method (i.e. 0.1% colchicine for 1.5 h).

Corymbia citriodora; pretreatment; chromosome

S722.3

A

2015-11-23

國家高技術(shù)研究發(fā)展計劃(863計劃)課題(2011AA100202)；林業(yè)公益性行業(yè)科研專項經(jīng)費項目(201504204)

收稿日期：劉思汝(1989— )，女，在讀碩士研究生，主要從事桉樹遺傳育種研究. E-mail:liusiruru@126.com

＊通訊作者：羅建中(1969— )，男，研究員，主要從事桉樹遺傳育種研究. E-mail: luojz69@hotmail.com