占今舜，楊宏波，詹康，劉紅，劉明美，趙國琦

(揚州大學動物科學技術學院，江蘇 揚州 225009)

豆科牧草紫花苜蓿在世界上廣泛分布，且享有盛譽，被稱為“牧草之王”。紫花苜蓿含有蛋白質等營養(yǎng)物質，是較好的飼料原料之一[1–2]。在西方，小黑麥草是主要的飼草之一；在中國，隨著農(nóng)業(yè)結構的調整，小黑麥草也被作為飼料作物進行開發(fā)。飼用小黑麥草具有相對較強的抗逆性，能夠于干旱瘠薄地、閑散廢棄地生長，對畜牧業(yè)的發(fā)展具有一定的促進作用[3]。

葡萄糖轉運蛋白(GLUTs)是細胞轉運葡萄糖的載體，介導葡萄糖在細胞膜兩側的轉運，廣泛分布于體內各種組織。GLUT1 是一種易化擴散的葡萄糖轉運蛋白，分布廣泛，具有維持基礎狀態(tài)下組織細胞葡萄糖攝入的功能。GLUT1 是反芻動物乳腺中主要的葡萄糖轉運蛋白[4–6]。細胞膜脂質和細胞內部多種信號分子等均由脂肪酸構成，而脂肪酸轉運蛋白(FATP)是促進脂肪酸轉運的蛋白之一。FATP4 是動物腸道中唯一存在的FATPs家族成員，存在于腸絨毛細胞，被認為是調控腸道細胞吸收脂肪酸的重要因子[7–8]。小肽轉運載體(PepT) 在腸道內參與二肽和三肽的跨膜轉運。組織和細胞中的PepT1 通過跨膜轉運肽類物質，對營養(yǎng)物質的吸收具有重要作用[9–10]。

飼料營養(yǎng)水平對葡萄糖、脂肪和小肽轉運蛋白具有調控作用。筆者將質量比3∶1 的苜蓿和小黑麥草制成不同精粗比的顆粒全價飼料，研究其對犢牛不同組織GLUT1、FATP4、PepT1 基因的影響，以從分子水平探明不同營養(yǎng)水平對動物營養(yǎng)物質吸收的影響。

1 材料與方法

1.1 試驗日糧和犢牛

根據(jù)NRC(2001)營養(yǎng)需要，采用20 型顆粒飼料機組，將質量比3∶1 的苜蓿和小黑麥草分別制成精粗比75∶25、70∶30、65∶35 和60∶40 的顆粒全價飼料。

將日齡(104.00±1.50) d、平均體重(121.25± 4.12) kg 的中國荷斯坦斷奶公犢牛12 頭分為4組，分別飼喂精粗比75∶25、70∶30、65∶35、60∶40 的顆粒全價飼料(分別稱其為試驗Ⅰ組、Ⅱ組、Ⅲ組、Ⅳ組)，預試期14 d，正試期 56 d。每天飼喂3次，飼喂時間為8:30、14:30 和20:30，每周調整1次飼喂量，但保證每組犢牛的干物質采食量基本一致。犢牛自由飲水，每天有6～7 h戶外活動。每日清晨打掃圈舍，每周至少對牛舍消毒2次。各試驗組飼糧的組成和營養(yǎng)水平見表1。

表1 飼糧組成和營養(yǎng)水平(干物質基礎) Table 1 Composition and nutrient levels of basal diets (DM basis)

1.2 方法

試驗于2014年3月至2014年5月在揚州大學實驗農(nóng)牧場進行。

1.2.1 樣品采集

于試驗第70天，每組犢牛禁食12 h 后進行屠宰，沿縱向剖開腹腔，分離出肝臟、瘤胃、十二指腸和肌肉。用高溫滅菌后的鑷子和手術剪刀剪取各組織，在滅菌生理鹽水中清洗，裝入1.5mL 的離心管中，液氮速凍后轉移到–80℃的冰箱冷凍保存。

1.2.2 組織總RNA 的提取和cDNA 的合成

根據(jù)RNA 提取試劑盒(天根生化科技有限公司)說明書進行組織總RNA 的提取，采用One Drop 儀測定總RNA 的濃度和純度。根據(jù)1%瓊脂糖凝膠電泳結果判斷RNA 是否有降解。采用Takara 反轉錄試劑盒進行cDNA 合成。試驗在冰上進行。反應體系10 μL。反應條件：37℃反轉入反應15min，85℃反轉入酶失活反應5 s；4℃保存。所得cDNA 保存于–20℃。

1.2.3 引物設計

根據(jù)Genbank 中的GAPDH、GLUT1、FATP4、PepT1 基因的序列，采用Primer 5.0 軟件設計。引物(表2)由Invitrogen 公司合成。

表 2 設計引物 Table 2 Primer design

1.2.4 Real Time–PCR 反應條件

根據(jù)TaKaRa 試劑盒說明書配制反應液(表3)。在羅氏Light Cycler? 96 PCR 儀上進行檢測。條件：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火20 s，40個循環(huán)；65℃延伸15 s。RT–PCR 反應液總體積20 μL，其中， SYBR 預混合試劑Ex TaqⅡ(2×)10 μL(終濃度1×)；10 μmol/L PCR 正向引物0.8 μL(終濃度0.4 μmol/L)，10 μmol/L PCR 反向引物0.8 μL(終濃度0.4 μmol/L)，cDNA 模板2 μL，滅菌蒸餾水6.4 μL。

1.3 數(shù)據(jù)分析

先用Excle 2007 對試驗數(shù)據(jù)進行預處理，根據(jù)公式2–△Ct計算出目的基因的相對表達量，其中△Ct＝Ct目的基因－Ct管家基因。采用SPSS 17.0 進行單因素方差分析，用LSD 法進行多重比較。

2 結果與分析

2.1 各試驗組犢牛不同組織中GLUT1 mRNA 的相對表達量

從表3 中可以看出，試驗Ⅲ組犢牛肝臟、瘤胃、十二指腸和盲腸的GLUT1 mRNA 相對表達量顯著高于試驗Ⅳ，試驗I組皺胃的GLUT1 mRNA 相對表達量極顯著高于試驗Ⅲ和Ⅳ組。

表3 不同組織中GLUT1 mRNA 的相對表達量 Table 3 Relative expression levels of GLUT1 mRNA in different tissues

2.2 各試驗組犢牛不同組織中FATP4 mRNA 的相對表達量

由表4 可見，試驗Ⅲ組犢牛肝臟中FATP4 mRNA 的相對表達量極顯著高于試驗Ⅳ組，顯著高于試驗I 和Ⅱ組；試驗I組瘤胃和十二指腸中FATP4 mRNA 的相對表達量顯著高于試驗Ⅲ組；試驗I組皺胃中FATP4 mRNA 的相對表達量極顯著高于試驗Ⅳ組；試驗Ⅲ組盲腸中FATP4 mRNA 的相對表達量顯著高于其他各組。

表4 不同組織中FATP4 mRNA 的相對表達量 Table 4 Relative expression levels of FATP4 mRNA in different tissues

2.3 各試驗組犢牛不同組織中PepT1 mRNA 的相對表達量

從表5 中可以看出，試驗Ⅱ和Ⅳ組犢牛肝臟中PepT1 mRNA 的相對表達量顯著高于試驗Ⅰ和Ⅲ組，試驗I 和Ⅳ組瘤胃中PepT1 mRNA 的相對表達量顯著高于試驗Ⅱ和Ⅲ組，試驗I組皺胃和十二指腸中PepT1 mRNA 的相對表達量顯著高于試驗Ⅳ組，試驗Ⅲ組盲腸中PepT1 mRNA 的相對表達量顯著高于試驗I 和Ⅳ組。

表5 不同犢牛組織中PepT1 mRNA 的相對表達量 Table 5 Relative expression levels of PepT1 mRNA in different tissues

3 結論與討論

不同精粗比飼糧顯著或極顯著地影響著綿羊瘤胃纖維素酶的活性[11]。采食精粗比20∶80、30∶70、和40∶60 的日糧，小尾寒羊纖維素和半纖維素消化量呈先上升后下降的趨勢[12]，說明適當?shù)木直热占Z可以促進纖維素的分解，進而提高葡萄糖的生成。潘巧等[13]發(fā)現(xiàn)，飼喂高精料日糧，奶山羊門靜脈吸收丙酸的量增加，導致肝臟增強吸收和利用丙酸，使肝臟糖異生相關酶基因的表達上調。當細胞外葡萄糖濃度增加時，細胞膜上GLUT1 的表達增加[14–15]。本試驗結果表明，除皺胃外，試驗Ⅲ組各組織中GLUT1 mRNA 的相對表達量最高，說明精粗比為65∶35 的日糧更利于犢牛吸收葡萄糖。試驗Ⅳ組皺胃的GLUT1 mRNA 相對表達量低于其他各組，可能是因為高精料日糧中淀粉的含量高，瘤胃淀粉分解菌占優(yōu)勢，淀粉被大量降解，未被瘤胃降解的部分淀粉則在皺胃中被消化酶分解成葡萄糖，導致GLUT1 基因表達升高，促進葡萄糖的吸收。

給COS1 細胞轉染FATP4 cDNA 導致棕櫚酰– CoA 合成酶和二十四烷基–CoA 合成酶升高[16]，表明FATP4 基因能夠編碼酰–CoA合成酶，說明FATP4在長鏈脂肪酸的攝取和代謝調節(jié)中發(fā)揮著重要作用。長鏈脂肪酸的合成原料是乙酰輔酶A，而反芻動物脂肪酸的合成是由瘤胃中形成的乙酸和丁酸轉化為乙酰輔酶A 和丁酰輔酶A 的。隨精料水平的增加，瘤胃乙酸、丁酸含量降低，丙酸含量增加[17]；隨采食時間的延長，揮發(fā)性脂肪酸含量呈先增加后降低趨勢。隨精粗比的升高，奶牛瘤胃的乙酸、丁酸含量降低[18]。本試驗中，試驗Ⅲ組肝臟FATP4基因的表達高于其他各組，可能是因為該組日糧使瘤胃產(chǎn)生的乙酸、丁酸含量高，導致肝臟合成脂肪酸多，促進肝臟對脂肪酸的轉運和代謝。飼料中的脂肪在瘤胃微生物作用下水解產(chǎn)生甘油和各種脂肪酸。在本試驗中，試驗I組瘤胃、皺胃和十二指腸FATP4 基因的表達量最高，這可能是因為該組日糧中含量較高的蛋白和脂肪在瘤胃微生物的作用下大量合成脂肪酸。

在本試驗中，試驗I組的日糧蛋白質水平最高，因此，在瘤胃降解成的小肽較多，進而導致瘤胃、皺胃和十二指腸的PepT1 mRNA 相對表達量最高。盲腸是反芻動物微生物消化的另一主要場所。王東升[19]等發(fā)現(xiàn)，高精粗比能顯著提高山羊盲腸內容物和盲腸靜脈的生物胺含量。本試驗中，試驗I組PepT1 基因的表達量最低，可能是由盲腸中產(chǎn)生的大量生物胺導致小肽生成較少引起。張樹坤等[20]發(fā)現(xiàn)，高精料飼喂泌乳期山羊，其肝臟中氨基酸消耗增多，同時小肽合成減少。本試驗中試驗I組肝臟的PepT1 mRNA 的相對表達量最低，可能是因為高精料引起肝臟合成小肽減少導致的。

綜合分析結果表明，精粗比為65∶35 的全價顆粒飼料能促進消化道GLUT1 基因的表達，精粗比為75∶25 的全價顆粒飼料能促進消化道FATP4、PepT1 基因的表達。從整體上看，精粗比為65∶35的全價顆粒飼料更有利于犢牛對葡萄糖、脂肪酸和蛋白質的吸收。

[1] 占今舜，陳佩佩，張彬．苜蓿在養(yǎng)豬生產(chǎn)上的應用研究進展[J]．養(yǎng)豬，2012(6)：27–30．

[2] 盧欣石．中國苜蓿產(chǎn)業(yè)發(fā)展問題[J]．中國草地學報，2013，35(5)：1–5．

[3] 謝楠，李源，趙海明，等．飼用黑麥、小黑麥品種的抗旱性評價[J]．中國草地學報，2011，33(6)：82–88．

[4] 劉越素，任躍忠．葡萄糖轉運蛋白–1 與糖尿病腎病[J]．國外醫(yī)學泌尿系統(tǒng)分冊，2004，24(3)：388–391．

[5] Christina P，Alexandra C，Jordan S，et al．Effects of cinnamaldehyde on theglucose transport actⅣity of GLUT1[J]．Biochimie，2011，93：339–344．

[6] 齊利枝，閆素梅，生冉，等．奶牛乳腺中乳成分前體物對乳成分合成影響的研究進展[J]．動物營養(yǎng)學報，2011，23(12)：2077–2083．

[7] 齊仁立，黃金秀，楊飛云，等．脂肪酸轉運蛋白家族及其介導的脂肪酸跨膜轉運[J]．動物營養(yǎng)學報，2013，25(5)：905–911．

[8] Blackburn C，Guan B，Brown J，et al．Identification and characterization of 4–aryl–3 ， 4–dihydropyrimidin–2 (1H)–ones as inhibitors of the fatty acid transporter FATP4[J]．Bioorganic & Medicinal Chemistry Letters，2006，16：3504–3509．

[9] Fei Y J，Sugawara M，Liu J C，et al．cDNA structure，genomic organization，and promoter analysis of the mouse intestinal peptide transporter PEPT1[J]. Biochimica et Biophysica Acta，2000，1492：145–154．

[10] 朱宇旌，王秉玉，張勇，等．小肽轉運載體1 的生物學特性及其功能[J]．動物營養(yǎng)學報，2012，24(10)：1847–1853．

[11] 霍鮮鮮，侯先志，趙志恭，等．不同精粗比日糧對綿羊瘤胃內纖維素酶活的影響[J]．甘肅畜牧獸醫(yī)，2003(5)：16–20．

[12] 門小明，雒秋江，唐志高，等．3 種不同精粗比日糧條件下空懷小尾寒羊母羊的消化與代謝[J]．中國畜牧獸醫(yī)，2006，33(10)：13–16．

[13] 潘巧．日糧精粗比對奶山羊肝臟糖異生的影響及其機理研究[D]．南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2012．

[14] 丁紅，馬健飛，樊怡，等．高糖對大鼠腹膜間皮細胞葡萄糖轉運蛋白1 調節(jié)作用的研究[J]．中國醫(yī)科大學學報，2006，35(2)：151–152．

[15] 任蕾．高血糖對大鼠腎皮質葡萄糖轉運蛋白l mRNA表達的影響[D]．沈陽：中國醫(yī)科大學，2008．

[16] Thomas H，F(xiàn)lorian B，Isabella G，et al．Mouse fatty acid transport protein 4 (FATP4): Characterization of thegene and functional assessment as a very long chain acyl–CoA synthetase[J]．Gene，2001，270:31–40．

[17] 華金玲，郭亮，王立克，等．不同精粗比日糧對黃淮白山羊瘤胃揮發(fā)性脂肪酸影響[J]．東北農(nóng)業(yè)大學學報，2013，44(6)：58–61．

[18] 賈玉東，王振勇，柴同杰，等．日糧粗精比對奶牛瘤胃液和血清乙酸、丙酸、丁酸的影響[J]．西北農(nóng)林科技大學學報：自然科學版，2008，36(7)：27–32．

[19] 王東升．日糧模式對瘤胃與后腸中生物胺生成的影響[D]．南京：南京農(nóng)業(yè)大學，2012．

[20] 張樹坤，姜雪元，倪迎冬，等．不同精粗比日糧對泌乳山羊肝臟蛋白質代謝及乳蛋白含量的影響[J]．農(nóng)業(yè)生物技術學報，2013，21(4)：413–420．