陸英，鄧林燕，朱麗娜，李覓路*

(1.湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝園林學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128；2.國(guó)家植物功能成分利用工程技術(shù)研究中心，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

鼠曲草(Gnaphlium affine D.Don)為菊科鼠曲草屬植物，又名佛耳草、清明菜等。鼠曲草提取物具有抗氧化及光防護(hù)[1]、抗炎抑菌[2]、抑制醛糖還原酶[3]、保肝[4]、昆蟲(chóng)拒食[5]等作用。鼠曲草能抑制血小板凝集和黏連，預(yù)防中風(fēng)、糖尿病及動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)生[6]。

α–淀粉酶抑制劑是糖苷水解酶抑制劑中的一種，它能有效抑制腸道內(nèi)唾液及胰淀粉酶的活性，降低食物中淀粉糖類(lèi)物質(zhì)的分解吸收，從而起到降低血糖、血脂的作用[7]。在農(nóng)業(yè)上，α–淀粉酶抑制劑能抑制昆蟲(chóng)消化道內(nèi)α–淀粉酶的活性，刺激昆蟲(chóng)過(guò)量分泌消化酶，產(chǎn)生厭食反應(yīng)，導(dǎo)致昆蟲(chóng)發(fā)育不良或死亡。近年來(lái)，α–淀粉酶抑制劑在醫(yī)學(xué)及農(nóng)業(yè)上得到了廣泛應(yīng)用。

筆者制備鼠曲草提取物，分離鑒定了鼠曲草提取物中的幾個(gè)多酚類(lèi)化合物，并研究了鼠曲草提取物及幾個(gè)組分對(duì)α–淀粉酶的抑制作用及其中的一個(gè)組分抑制類(lèi)型，旨在為鼠曲草資源的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試鼠曲草與試劑

鼠曲草于2012年4月中旬購(gòu)于湖南吉首。

豬胰α–淀粉酶(SIGMA公司)；阿卡波糖(北京拜耳醫(yī)藥保健有限公司)；可溶性淀粉(汕頭市西隴化工有限公司)；葡萄糖(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；二水磷酸氫二鈉、氯化鈉、正磷酸、3,5–二硝基水楊酸、氫氧化鈉、四水酒石酸鉀鈉等均為國(guó)產(chǎn)，分析純。

1.2 儀器

LC–10AT 高效液相色譜(日本島津公司)，WondasilTMC18色譜柱(250 mm×4.6 mm, 5 μm)；HH 數(shù)顯恒溫水浴鍋(江蘇省金壇市金城國(guó)勝實(shí)驗(yàn)儀器廠)；UV–2600 型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(尤尼柯(上海)儀器有限公司)；SK–1 快速混勻器(江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司)。

1.3 鼠曲草提取物的制備、分離和鑒定

鼠曲草提取物的制備：新鮮的鼠曲草于室內(nèi)自然陰干，置60℃烘箱中干燥后粉碎。取鼠曲草粉碎原料200g，用70%乙醇，料液比為1∶30，在80℃回流提取1 h，提取2次，合并提取液，過(guò)濾減壓濃縮至無(wú)醇味，用鹽酸調(diào)節(jié)pH 至3.0，將提取液通過(guò)D101 樹(shù)脂(3 cm×60 cm，450mL)上樣，流速4 BV/h，吸附后靜置0.5 h，用1 BV 水洗去水溶性雜質(zhì)，再用4 BV 的60%乙醇以3 BV/h 的流速洗脫，減壓濃縮后冷凍干燥，得鼠曲草提取物6.44g，于4℃冰箱中保存。

鼠曲草提取物的分離和鑒定：采用分析型高效液相色譜儀對(duì)提取物進(jìn)行分離鑒定。色譜條件如下：流動(dòng)相A 泵為0.5% 冰乙酸，B 泵為甲醇。梯度洗脫：0min(70%A 泵+30% B 泵)→15min(55%A泵+45% B 泵)→25min(55%A 泵+45% B 泵)→40min(30%A 泵+70% B 泵)，流速為1mL/min，柱溫為30℃，進(jìn)樣量為20 μL，檢測(cè)輸出波長(zhǎng)328 nm。

1.4 鼠曲草提取物及組分對(duì)α–淀粉酶的抑制作用試驗(yàn)

1.4.1 最適酶濃度和最適反應(yīng)時(shí)間的選擇

取7支試管，分別加入質(zhì)量濃度為0.02mg/mL的α–淀粉酶0.1mL，置于37℃水浴中預(yù)熱10min，加入37℃預(yù)熱的1%淀粉溶液0.1mL，酶反應(yīng)開(kāi)始后準(zhǔn)確計(jì)時(shí)，每間隔1min加入0.2mL DNS終止反應(yīng)，置沸水中水浴8min，迅速冷卻后用5mL蒸餾水稀釋?zhuān)梅止夤舛扔?jì)于540 nm處測(cè)定吸光值。改變酶濃度(0.04、0.06、0.08、0.1mg/mL)，同法測(cè)定吸光值，作圖確定最適酶濃度和最適反應(yīng)時(shí)間。

1.4.2 鼠曲草提取物及組分對(duì)α–淀粉酶的抑制作用試驗(yàn)

取0.1mL質(zhì)量濃度為0.06mg/mL豬胰α–淀粉酶溶液于試管中，分別加入0.1mL不同濃度(1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL)的樣品溶液(以阿卡波糖為陽(yáng)性對(duì)照)，混合均勻并置于37℃水浴中預(yù)熱10min，加入0.1mL 37℃預(yù)熱的1%淀粉溶液，混勻，反應(yīng)3min后立即加0.2mL DNS顯色劑，置沸水中水浴8min，迅速冷卻后用5mL蒸餾水稀釋?zhuān)梅止夤舛扔?jì)于540 nm處測(cè)定吸光值A(chǔ)1。以空白管為對(duì)照，不加抑制劑(以蒸餾水補(bǔ)足)，其他與抑制劑管操作相同，測(cè)定吸光值A(chǔ)0。背景管為對(duì)應(yīng)濃度的抑制劑溶液，不加酶液(以蒸餾水補(bǔ)足)，其他與抑制劑管操作相同，測(cè)定吸光值A(chǔ)2，按下列公式計(jì)算抑制率。

1.5 2′,4,4′–三羥基–6′–甲氧基–查爾酮–4′–O–β–D–葡萄糖抑制類(lèi)型的鑒別試驗(yàn)

2′,4,4′–三羥基–6′–甲氧基–查爾酮–4′–O–β–D–葡萄糖的質(zhì)量濃度為3mg/mL，底物為1%淀粉溶液，以緩沖溶液替代樣品溶液，在不同的酶濃度(0.02、0.04、0.06、0.08mg/mL)下按1.4.2反應(yīng)測(cè)定吸光值。當(dāng)體系中不存在抑制劑時(shí)，酶活性測(cè)定的速率直線通過(guò)原點(diǎn)；當(dāng)體系中存在不可逆抑制劑時(shí)，酶反應(yīng)速率直線不通過(guò)原點(diǎn)，相當(dāng)于將原點(diǎn)平行向右移動(dòng)，若有一定量的可逆性抑制劑時(shí)，可得到一條通過(guò)原點(diǎn)、斜率低于無(wú)抑制劑組的直線。如果2′,4,4′–三羥基–6′–甲氧基–查爾酮–4′–O–β–D–葡萄糖是可逆性抑制類(lèi)型化合物，則進(jìn)一步進(jìn)行可逆性抑制類(lèi)型(競(jìng)爭(zhēng)型和非競(jìng)爭(zhēng)型)的鑒別試驗(yàn)。試驗(yàn)操作如下：固定酶質(zhì)量濃度為0.06mg/mL，2′,4,4′–三羥基–6′–甲氧基–查爾酮–4′–O–β–D–葡萄糖質(zhì)量濃度為3mg/mL，以淀粉溶液為底物，在不同濃度(0.5%、1%、1.5%和2%)的淀粉溶液下，按1.4.2 反應(yīng)測(cè)定吸光值，通過(guò)雙倒數(shù)作圖法判斷是競(jìng)爭(zhēng)型或非競(jìng)爭(zhēng)型抑制類(lèi)型。兩條直線的交點(diǎn)在縱軸為競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑，在橫軸上的為非競(jìng)爭(zhēng)型抑制劑。

2 結(jié)果與分析

2.1 鼠曲草提取物的HPLC 分析

鼠曲草提取物的HPLC 色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可見(jiàn)，提取物中含有多個(gè)組分，其中含量相對(duì)較高的有7個(gè)組分，在330 nm 和220 nm 左右有較大吸收，具有明顯的酚酸類(lèi)化合物的紫外吸收特征[9]，推測(cè)為多酚類(lèi)化合物。本課題組從鼠曲草提取物中制備分離得到了7個(gè)組分，并鑒定出編號(hào)為3、5、7 的組分分別為3,5–O–咖啡?；鼘幩?、3,4–O–咖啡?；鼘幩帷?′,4,4′–三羥基–6′–甲氧基–查爾酮–4′–O–β–D–葡萄糖。

圖1 鼠曲草提取物的HPLC 圖譜 Fig.1 HPLC chromatogram of the extract from Gnaphalium affine D. Don

2.2 鼠曲草提取物及組分對(duì)α–淀粉酶的抑制作用及抑制類(lèi)型鑒別結(jié)果

2.2.1 最適酶濃度和最適反應(yīng)時(shí)間的確定

不同質(zhì)量濃度的α–淀粉酶在7min內(nèi)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)進(jìn)程曲線見(jiàn)圖2。當(dāng)酶質(zhì)量濃度等于或低于0.08mg/mL時(shí)，在3min之內(nèi)反應(yīng)均為線性反應(yīng)。同時(shí)，為利于建立科學(xué)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方程，使測(cè)定的反應(yīng)速率(以ΔA/min表示)在(0.03～0.25)/min較好[9]，因此，選取最佳酶濃度0.06mg/mL，反應(yīng)時(shí)間3min進(jìn)行酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的測(cè)定。

圖2 不同質(zhì)量濃度α–淀粉酶的反應(yīng)進(jìn)程曲線 Fig.2 The reaction curve under different concentrations of α- amylase

2.2.2 鼠曲草提取物及3個(gè)組分對(duì)α–淀粉酶活性的影響

不同濃度的鼠曲草提取物及化合物對(duì)α–淀粉酶的抑制活性見(jiàn)表1。在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，樣品對(duì)α–淀粉酶活性均有一定抑制作用，隨著濃度的增加，抑制能力逐漸增強(qiáng)。當(dāng)提取物、組分3、5、7及陽(yáng)性對(duì)照阿卡波糖質(zhì)量濃度為1.67mg/mL時(shí)，抑制率分別為32.37%、84.53%、63.07%、71.22%、94.12%。對(duì)樣品濃度與抑制率進(jìn)行線性擬合，得到線性方程為：y提=17.265x + 3.237(R2= 0.998 4)；y3=45.429x + 9.247(R2= 0.997 6)；y5= 34.041x + 6.555(R2= 0.999 4)；y7=40.239x + 3.293(R2=0.993)；y阿=28.92x + 47.194 (R2=0.988 9)。根據(jù)方程計(jì)算出提取物及化合物3、5、7對(duì)α–淀粉酶的半抑制濃度IC50分別為2.71、0.90、1.28、1.16mg/mL，均高于阿卡波糖的半抑制濃度(0.10mg/mL)。

表1 樣品對(duì)α–淀粉酶的抑制作用 Table 1 Inhibitory effect of coumpounds from Gnaphalium affine D. Don on α-amylase

2.2.3 2′,4,4′–三羥基–6′–甲氧基–查爾酮–4′–O–β–D–葡萄糖對(duì)α–淀粉酶的抑制類(lèi)型

不同濃度的α–淀粉酶在有或無(wú)2′,4,4′–三羥基–6′–甲氧基–查爾酮–4′–O–β–D–葡萄糖存在的條件下的反應(yīng)速率見(jiàn)圖3。無(wú)抑制組的速率方程為y=0.488 5x(R2=0.986)，抑制組的速率曲線方程為y=0.269 5x (R2=0.987 8)，此直線通過(guò)原點(diǎn)，由此可知，化合物7對(duì)α–淀粉酶的抑制類(lèi)型是可逆性抑制。由圖4可知，抑制組雙倒數(shù)曲線方程為y=288.91x+ 54.848(R2=0.978 4), 無(wú)抑制組雙倒數(shù)曲線方程為y=145.81x+27.94 (R2=0.997 4)，方程直線在橫軸上相交，為非競(jìng)爭(zhēng)性抑制。

圖4 化合物7對(duì)胰α–淀粉酶的可逆抑制類(lèi)型的雙倒數(shù)曲線 Fig.4 Lineweaver-burk plot for inhibition of compound 7 on α–amylase

3 結(jié)論

植物多酚由于具有良好的抗氧化和自由基清除活性而受到廣泛關(guān)注。近些年進(jìn)一步研究[10–12]表明，一些植物的多酚如藍(lán)莓提取物、茶多酚等具有 較強(qiáng)的α–淀粉酶抑制活性。本試驗(yàn)結(jié)果表明，鼠曲草提取物及其中的3個(gè)多酚類(lèi)化合物對(duì)胰α–淀粉酶均具有較強(qiáng)的抑制作用，且呈明顯的量效關(guān)系，但不同化合物的抑制活性存在一定差異，3,5–O–咖啡酰基奎寧酸、3,4–O–咖啡?；鼘幩釣楫惥G原酸類(lèi)化合物的同分異構(gòu)物，但二者抑制α–淀粉酶的IC50分別為0.90、1.28mg/mL；2′,4,4′–三羥基–6′–甲氧基–查爾酮–4′–O–β–D–葡萄糖是一種查爾酮，它的IC50為1.16mg/mL，同時(shí)它為可逆的非競(jìng)爭(zhēng)性抑制類(lèi)型。

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