陳銀岳，孫葉,2，霍永久，占今舜，劉明美，詹康，趙國琦*

(1.揚州大學(xué)動物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇 揚州 225009；2.揚州循天嶺生物科技有限公司，江蘇 揚州 225009)

蛹蟲草(Cordyceps military)，又名北冬蟲夏草、北蛹蟲草等，屬于麥角菌科真菌屬子囊菌種[1]。蛹蟲草含有多種生物活性物質(zhì)，包括蟲草素、蟲草多糖、甘露醇(蟲草酸)、類胡蘿卜素以及多種氨基酸等[2–3]，其中對蟲草多糖、蟲草素、蟲草酸等的研究報道較多[4–6]，而涉及蟲草類的胡蘿卜素相關(guān)報道較少。類胡蘿卜素是一類由8個異戊二烯單位連接而成的親脂化合物[7]，可用作天然色素添加劑，應(yīng)用于食品、化妝品等領(lǐng)域[8]。有研究指出，化工合成的類胡蘿卜素不具有抗病效果[9]，而天然類胡蘿卜素具有較好的抗癌、抗氧化功效[10–11]，所以開展天然類胡蘿卜素的提取工藝研究很有必要。Dong等[12]從蛹蟲草中提取出一類新的類胡蘿卜素，并指出這種類胡蘿卜素具有一定的水溶性，更易于機(jī)體吸收，這引發(fā)了天然類胡蘿卜素研究領(lǐng)域的又一次激烈討論。

常用類胡蘿卜素的提取方法包括溶劑萃取法、酶反應(yīng)法、微波提取法、超聲提取法以及超臨界流體萃取法等[13]。酶反應(yīng)法需要使用價格昂貴的酶，而超臨界流體萃取法需要專門的儀器設(shè)備，考慮到現(xiàn)有的設(shè)備條件以及試驗成本，計劃采用溶劑萃取法，并在前人成果的基礎(chǔ)上設(shè)計不同的試驗處理方法，提取蛹蟲草類胡蘿卜素，對比提取得率，得出較好的提取方法并對該方法的提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以提高提取得率，為蛹蟲草類胡蘿卜素生物活性的研究及其產(chǎn)品開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草子實體品種為‘cm–20’，由揚州市農(nóng)科院輻照中心提供，常溫保存。β–類胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品購自Sigma公司。丙酮、氯仿、石油醚、2,6–二叔丁基對甲酚(BHT)等購自國藥集團(tuán)，為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

LyoQUEST–55冷凍干燥機(jī)(德菲科學(xué)儀器有限公司)；FW80高速萬能粉碎機(jī)(天津市泰斯特儀器有限公司)；KQ–500DE超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；EM720微波爐(美的集團(tuán))；FA2004萬分天平(上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)；UV7502c紫外可見分光光度計(上海壘固儀器有限公司)；SpectraMax M5酶標(biāo)儀(美谷分子儀器有限公司)。

1.3 方法

由于類胡蘿卜素遇高溫、光照、氧氣環(huán)境易降解，故試驗的所有操作都在弱光或無光條件下進(jìn)行。

1.3.1 蛹蟲草粉末的制備

首先將所獲得的蛹蟲草子實體置于冷凍干燥機(jī)內(nèi)進(jìn)行干燥，然后將凍干至恒重的蛹蟲草子實體放入粉碎機(jī)中粉碎，過孔徑為0.25 mm 的篩，將過篩后的樣品放入錫箔紙包裹的廣口瓶中密封，保存于－30℃冰柜中。

1.3.2 β–胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)曲線方程的建立

稱取4.6mg β–胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)品，加入2mL 氯仿，然后用石油醚定容至50mL。取定容好的石油醚溶液1mL 用丙酮定容至10mL，再分別取定容好的丙酮溶液0、0.2、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，用丙酮定容至2mL，用分光光度計在450 nm 處測吸光度值。以吸光度值為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)β–胡蘿卜素濃度為橫坐標(biāo)，作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得出線性回歸方程為y=0.129x–0.09, R2=0.999 3，類胡蘿卜素含量計算公式：c=x·V/m。式中x 為根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算出的提取液中類胡蘿卜素含量(μg/mL)；V 為丙酮提取液體積(mL)；m 為稱取的粉末樣品質(zhì)量(g)。

1.3.3 不同提取方法試驗

在溶劑萃取的基礎(chǔ)上，設(shè)計不同的試驗處理法，比較不同方法的提取效果，得出較好提取方法。具體如下：

1) 酸熱提取法。參考張志軍等[14]優(yōu)化的酸熱提取法(下稱“優(yōu)化法”)試驗方案進(jìn)行蛹蟲草類胡蘿卜素的提?。悍Q取0.200g蛹蟲草粉末，按料液比1∶10 加入2 mol/L 鹽酸，浸泡40min，沸水浴4min，迅速冷卻，加入蒸餾水洗滌，3 000 r/min 離心10min，棄上清液，重復(fù)洗滌1次。加入15mL 丙酮和適量抗氧化劑，室溫下浸提30min，3 000 r/min離心10min，得上清液，即為類胡蘿卜素提取液，之后用相同體積丙酮清洗沉淀2次，合并收集上清液，重復(fù)3次。

2) 超聲提取法。稱取0.200g 蛹蟲草粉末，加入15mL 丙酮和適量抗氧化劑，室溫下超聲處理30min(時刻監(jiān)控水溫，超聲功率300 W)，之后3 000 r/min 離心10min，得上清液，即為類胡蘿卜素提取液，之后用相同體積丙酮清洗沉淀2次，合并收集上清液，重復(fù)3次。

3) 酸熱超聲提取法。稱取0.200g 蛹蟲草粉末，按料液比1∶10 加入2 mol/L 鹽酸，浸泡40min，沸水浴4min，迅速冷卻，加入蒸餾水洗滌，3 000 r/min 離心10min，棄上清液，重復(fù)洗滌1次。加入15mL 丙酮和適量抗氧化劑，室溫下超聲處理30min(時刻監(jiān)控水溫，超聲功率300 W)，之后3 000 r/min 離心10min，得上清液，即為類胡蘿卜素提取液。用相同體積的丙酮清洗沉淀2次，合并收集上清液，重復(fù)3次。

4) 微波提取法。稱取0.200g 蛹蟲草粉末，加入15mL 丙酮和適量抗氧化劑，微波功率70 W 處理3min，室溫下浸提27min，3 000 r/min 離心10min，得上清液，即為類胡蘿卜素提取液。用相同體積的丙酮清洗沉淀2次，合并收集上清液，重復(fù)3次。

5) 酸熱微波提取法。稱取0.200g 蛹蟲草粉末，加2 mol/L 鹽酸2mL，浸泡40min，沸水浴4min, 迅速冷卻，加入蒸餾水，3 000 r/min 離心10min，棄上清液，重復(fù)洗滌1次。加入15mL 丙酮和適量抗氧化劑，微波功率70 W 處理3min，室溫下浸提27min，3 000 r/min 離心10min，得上清液，即為類胡蘿卜素提取液。用相同體積丙酮清洗沉淀2次，合并收集上清液，重復(fù)3次。

6) 丙酮提取法。稱取0.200g 蛹蟲草粉末，加入15mL 丙酮和適量抗氧化劑，研磨3min，室溫下浸提27min，3 000 r/min 離心10min，得上清液即為類胡蘿卜素提取液。用相同體積的丙酮清洗沉淀2次，合并收集上清液，重復(fù)3次。

分別取等量上述6 種方法提取得到的類胡蘿卜素丙酮溶液，并加等體積蒸餾水混勻，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行光譜掃描，掃描波長為400～600 nm，掃描間隔5 nm，得吸收光譜圖。

收集經(jīng)酸熱處理后的2次水洗液，在酶標(biāo)儀上進(jìn)行光譜掃描，掃描波長范圍為400～600 nm，掃描間隔5 nm，得吸收光譜圖。

1.3.4 酸熱超聲提取法單因素試驗

比較6 種不同提取方法的結(jié)果，得出酸熱超聲提取法為較好的提取方法。針對鹽酸濃度(0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mol/L)，酸浸時間(20、30、40、50、60、70min)，沸水浴時間(3、5、7、9、11min)，超聲功率(250、300、350、400、450 W)，超聲溫度(10、20、30、40、50、60 )℃，超聲時間(10、20、30、40、50min)6個因素按1.3.3 中酸熱超聲提取法進(jìn)行單因素試驗，以此來確定正交試驗中因素的水平范圍。

1.3.5 正交試驗

根據(jù)單因素試驗的結(jié)果，設(shè)計正交試驗方案并進(jìn)行正交試驗，以確定最優(yōu)提取條件。

表1 正交試驗因素及水平 Table 1 Orthogonal factor level table

1.3.6 驗證性試驗

分別以蛹蟲草粉末和新鮮蛹蟲草子實體為材料，按照正交試驗結(jié)果中最佳提取工藝進(jìn)行試驗，測定類胡蘿卜素的提取得率。

1.4 數(shù)據(jù)分析方法

采用Excel 2003進(jìn)行繪圖分析，利用SPSS16.0進(jìn)行一元線性相關(guān)分析及正交試驗的方差分析和Duncan多重比較分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同提取方法提取蛹蟲草類胡蘿卜素比較

酸熱提取法的平均得率為986.05μg/g，遠(yuǎn)沒有張志軍等以此法提取得到2 158μg/g的高。分析原因，可能是提取方法不適宜或者菌種及來源的不同所導(dǎo)致類胡蘿卜素提取得率的差別，因此，在提取本品種蛹蟲草類胡蘿卜素時，有必要進(jìn)一步探究不同的處理方法并且優(yōu)化提取條件。

提取液掃描光譜如圖2所示，3條光譜曲線(E1、E2、E3)呈現(xiàn)明顯的三峰狀(三峰狀譜線為類胡蘿卜素特征譜線[14–16])，由此可知，酸熱提取法、酸熱超聲提取法以及酸熱微波提取法都能從蛹蟲草中提取到類胡蘿卜素。蛹蟲草類胡蘿卜素的最大吸收峰在450 nm處。E3(酸熱超聲提取法)所得蛹蟲草類胡蘿卜素提取液的吸收值最大，所以酸熱超聲法是較好的提取方法。后3條譜線(E4、E5、E6)沒有明顯特征，這表明超聲提取法、微波提取法以及丙酮提取法不能明顯從蛹蟲草中提取到類胡蘿卜素。

圖1 6 種不同方法所得丙酮提取液的光譜掃描圖譜 Fig.1 Spectrum chart of extracting solution from different extraction methods

收集酸熱處理后的水洗液在450 nm波長下掃描，結(jié)果如圖2所示。2次水洗液的掃描曲線均未呈現(xiàn)特征圖譜，故認(rèn)為廢棄的水洗液中不含有類胡蘿卜素。

圖2 水洗液掃描光譜 Fig.2 Spectrum chart of water

2.2 單因素試驗結(jié)果

從表2可以看出，隨著鹽酸濃度增加，蛹蟲草類胡蘿卜素提取得率逐漸增加，當(dāng)鹽酸濃度為2.5 mol/L時，得率最高，為1 030.81μg/g，進(jìn)一步增加鹽酸濃度，得率迅速下降，確定較適宜的鹽酸濃度為2.5 mol/L。當(dāng)酸浸時間為30min時，蛹蟲草類胡蘿卜素提取得率最高，為1 070.93μg/g，隨酸浸時間延長，得率逐漸降低，確定較適宜的酸浸時間為30min。當(dāng)沸水浴時間為5min時，蛹蟲草類胡蘿卜素提取得率達(dá)到最高，為1 090.12μg/g，水浴時間延長，提取得率下降，確定較適宜的沸水浴時間為5min。超聲功率在250～350 W時，提取得率變化不大，當(dāng)功率達(dá)到400 W時，提取得率升至最高，為994.19μg/g，隨著超聲功率的增大，提取得率下降，確定較適宜的超聲功率為400 W。當(dāng)溫度為10℃時，由于溫度較低，類胡蘿卜素的溶解度不夠，所以得率較低。當(dāng)溫度提高到20℃時，提取得率最高，為1 161.63μg/g，之后隨超聲溫度升高，得率逐漸下降，當(dāng)溫度達(dá)到50℃時，得率下降明顯，確定較適宜的提取溫度為20℃。當(dāng)超聲時間為20min時，提取得率最高，為1 090.86μg/g，之后隨時間延長，得率稍有降低，確定較適宜的超聲時間為20min。

表2 單因素試驗結(jié)果 Table 2 Requirements and Results of Single Factor

表2 (續(xù))

綜上所述，確定鹽酸濃度梯度為2.25、2.50、2.75 mol/L，酸浸時間梯度為為25、30、35min，沸水浴時間梯度為4、5、6min，超聲功率梯度為350、400、450 W，超聲溫度梯度為15、20、25℃，超聲時間梯度為15、20、25min作為正交試驗各因素的水平。

2.3 正交試驗結(jié)果

從表3和表4可知，6個試驗因素中，鹽酸濃度、酸浸時間和超聲功率對提取得率的影響達(dá)到顯著水平，而沸水浴時間、超聲溫度和超聲時間對試驗結(jié)果的影響沒有統(tǒng)計學(xué)意義；對提取得率大小的影響因素順序為超聲功率、酸浸時間、鹽酸濃度、沸水浴時間、超聲溫度、超聲時間。Duncan多重比較分析結(jié)果表明，鹽酸濃度2.25 mol/L提取效果較好，酸浸時間30min和超聲功率400 W提取效果較好，沸水浴時間、超聲溫度和超聲時間的3個水平間無顯著差異，沸水浴時間6min和超聲時間25min提取效果較好，超聲溫度選擇25℃更利于試驗操作，所以最優(yōu)水平組合為鹽酸濃度2.25 mol/L，酸浸時間30min，沸水浴時間6min，超聲功率400 W，超聲溫度25℃，超聲時間25min。

表3 正交試驗結(jié)果 Table 3 The project of orthogonal test and the results of extraction

表3 (續(xù))

表4 方差分析結(jié)果 Table 4 The table of variance analysis

2.4 驗證試驗結(jié)果

按照優(yōu)化后的提取條件，得到蛹蟲草類胡蘿卜素的平均提取得率為1 105.53μg/g，新鮮子實體類胡蘿卜素平均提取得率為1 134.88μg/g。

3 討論與結(jié)論

蛹蟲草屬于寄生真菌，表面覆蓋有堅實細(xì)胞壁，用鹽酸處理可以使細(xì)胞壁中原來結(jié)構(gòu)緊密的某些成分(多糖和蛋白質(zhì)等)變得疏松，同時配合沸水浴處理以及快速冷卻處理，使細(xì)胞壁得以破壞，胞內(nèi)類胡蘿卜素才更容易釋放出來[17]。另外，在酸熱處理基礎(chǔ)上，利用超聲波產(chǎn)生的空化效應(yīng)使細(xì)胞內(nèi)形成空腔，使類胡蘿卜素更容易從細(xì)胞中釋放出來，而利用微波處理雖然也有利于胞內(nèi)類胡蘿卜素釋放，但提取效果不及超聲波處理的效果好。

提取過程中涉及到的各因素都會對類胡蘿卜素的提取得率產(chǎn)生影響。鹽酸浸泡配合沸水浴快速冷處理可以疏松蛹蟲草子實體的細(xì)胞壁，便于類胡蘿卜素從胞內(nèi)釋放，但鹽酸濃度、酸浸時間以及沸水浴時間都需取值適當(dāng)，不可過長，否則類胡蘿卜素一旦釋放出來后很快會被酸和熱破壞，導(dǎo)致提取得率下降。用超聲波處理酸浸后的蟲草粉末將更有利于類胡蘿卜素的釋放，但同時也需要控制好超聲處理的功率、時間和水溫，恰當(dāng)?shù)乃釤崽幚砗统暡ㄕ袷幠茏畲蟪潭壬媳ＷC類胡蘿卜素在提取過程中的穩(wěn)定性。

蛹蟲草收獲后，保藏條件如光照、濕度以及溫度等對類胡蘿卜素的穩(wěn)定性有一定影響，采用新鮮的蛹蟲草子實體進(jìn)行試驗?zāi)茏畲蟪潭壬咸崛〉礁嗟念惡}卜素。本試驗中新鮮子實體的提取得率為1 134.88μg/g，低于張志軍、王陶[18]報道的蛹蟲草類胡蘿卜素提取得率，原因可能是所使用的蛹蟲草品種不同所致。針對這一問題，未來可以通過菌種篩選以及采用轉(zhuǎn)基因技術(shù)等手段選育蛹蟲草品種，以提高蛹蟲草類胡蘿卜素提取得率。

綜合整個試驗結(jié)果，得出以下結(jié)論：

1) 酸熱超聲提取法為本品種蛹蟲草類胡蘿卜素提取的較好方法。

2) 酸熱超聲提取法中對提取得率影響從大到小的因素依次為超聲功率、酸浸時間、鹽酸濃度、沸水浴時間、超聲溫度、超聲時間。

3) 優(yōu)化后的提取工藝為鹽酸濃度2.25 mol/L，酸浸時間30min，超聲功率400 W，沸水浴時間6min，超聲溫度25℃，超聲時間25min，新鮮蛹蟲草類胡蘿卜素的提取得率達(dá)1 134.88μg/g。

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