王小寧，馮鎖民，張存勞

(西安醫(yī)學(xué)院 藥學(xué)院，陜西 西安 710021)

酮洛芬屬苯丙酸類非甾體抗炎藥，在臨床上主要用于治療各種關(guān)節(jié)炎、術(shù)后疼痛及慢性癌痛等。但酮洛芬難溶于水，口服會對胃腸道有刺激作用，表現(xiàn)為消化道的潰瘍、惡心、嘔吐等不良反應(yīng)。為避免上述不良反應(yīng)，對酮洛芬的非口服劑型研究已經(jīng)受到越來越多的關(guān)注［1-3］。其中，經(jīng)皮給藥制劑可以避免胃腸道副作用和首過效應(yīng)，提高局部藥物濃度，具有使用方便、可隨時中斷給藥及緩控釋等諸多優(yōu)點而受到了廣泛關(guān)注。醇質(zhì)體是一種新型經(jīng)皮給藥制劑，由磷脂、高比例乙醇、水組成，具有脂質(zhì)體雙分子層結(jié)構(gòu)，易于變形，流動性較高，可促進(jìn)藥物穿透皮膚吸收［4］。本論文制備酮洛芬醇質(zhì)體，對其體外經(jīng)皮滲透特性進(jìn)行考察，為研制酮洛芬較好的經(jīng)皮吸收制劑奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 材料與儀器

酮洛芬原料藥、卵磷脂、膽固醇均為醫(yī)藥級;甲醇，色譜級。

HJ-2 雙頭磁力加熱攪拌器;S-450D 型探針式超聲儀;ALC-210.4 型電子天平;KQ3200E 型超聲波清洗器;PYJ-6B 型透皮擴(kuò)散試驗儀;Delsa Nano C Zeta 電位分析儀型;Agilent1260 型高效液相色譜儀。

1.2 實驗方法

1.2.1 酮洛芬醇質(zhì)體的制備 稱取酮洛芬于80 mL燒杯中，加無水乙醇使其完全溶解，稱取卵磷脂于燒杯中，密封，超聲，使卵磷脂溶解，在密封條件下，將其置于磁力攪拌器上，緩緩加入pH=7.0 的磷酸鹽緩沖液，繼續(xù)攪拌30 min，過0.22 μm 濾膜，即得。

1.2.2 酮洛芬脂質(zhì)體的制備 稱取卵磷脂與膽固醇(2∶1)置茄形瓶中，加入適量氯仿溶解，再加入以甲醇溶解的酮洛芬溶液，混合均勻，45 ℃恒溫水浴中旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)溶劑至形成薄膜后，取PBS(pH 7.0)加入薄膜中，振搖直至將膜全部洗下，再置于25 ℃水浴中旋轉(zhuǎn)水化30 min，即得。

1.2.3 酮洛芬乙醇溶液的制備 精密稱取酮洛芬0.12 g，加30 mL 無水乙醇使其溶解，置于100 mL容量瓶中，純化水定容至刻度，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 酮洛芬含量測定方法

2.1.1 色譜條件 Agilent HC-C18(2)(4.6 mm ×150 mm，5 μm)，流動相:甲醇-0.05 mol/L 磷酸二氫鉀(55 ∶45)，柱溫25 ℃，檢測波長258 nm，流速1.0 mL/min，進(jìn)樣量20 μL。

2.1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制 精密稱取酮洛芬0.05 g，加甲醇使其溶解并定容至100 mL。精密吸取供試液0.1，0.3，0.6，1.2，1.8，2.4 mL 分別于100 mL 容量瓶中，甲醇定容至刻度，即得濃度分別為0.50，1.50，3.00，6.00，9.00，12.00 μg/mL 的對照液，按2.1.1 節(jié)下的色譜條件測其峰面積。以濃度C 為橫坐標(biāo)，峰面積A 為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為:Y=59.858X+15.556，R2=0.999 9，表明酮洛芬在0.50 ～12.00 μg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3 精密度實驗 取2.1.2 節(jié)下的同一濃度的酮洛芬溶液(9.00 μg/mL)，按照2.1.1 節(jié)色譜條件測定，連續(xù)進(jìn)樣6 次，計算RSD 值為1.8%，表明精密度良好。

2.1.4 穩(wěn)定性實驗 取2.1.2 節(jié)下的同一濃度的酮洛芬溶液(9.00 μg/mL)，分別在0，1，2，3，6，12 h，按照2.1.1 節(jié)下的色譜條件進(jìn)樣測定，計算RSD 值為3.1%，表明在12 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.5 加樣回收率實驗 ①空白醇質(zhì)體的制備:量取無水乙醇于燒杯中，稱取卵磷脂，密閉條件下在超聲清洗器中超聲溶解后將其置于磁力攪拌器上，密封條件下緩緩加入pH=7.0 的磷酸鹽緩沖液，繼續(xù)攪拌30 min，過0.22 μm 濾膜，即得。②加樣回收率的測定:精密吸取2.1.2 節(jié)下的對照液0.3，1，2 mL 分別于100 mL 容量瓶中，分別加0.5 mL 空白醇質(zhì)體，甲醇稀釋至刻度，按2.1.1 節(jié)下給定的色譜條件測定，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率實驗Table 1 Results of the sample recovery tests

由表1 可知，在低、中、高濃度測得的回收率分別為(96. 6 ± 0. 86)%，(96. 6 ± 1. 03)%，(97. 5 ±1.8)%。表明回收率良好。

2.2 粒徑、Zeta 電位值及包封率的測定

酮洛芬醇質(zhì)體和脂質(zhì)體的粒徑及Zeta 電位值由激光散射粒徑分析儀測得，粒徑分布見圖1。包封率采用透析法測定:分別移取酮洛芬醇質(zhì)體，酮洛芬脂質(zhì)體2 mL 于透析袋中，將其放入含200 mL 的磷酸鹽緩沖液(pH =7.0)的燒杯中，于磁力攪拌器上，20 h后取樣，按照2.1.1 節(jié)下的色譜條件測定游離藥物，按照下列公式計算其包封率。

圖1 酮洛芬醇質(zhì)體的粒徑及粒徑分布圖Fig.1 Particle size and size distribution of ketoprofen ethosomes

式中，W游為游離藥物濃度，W總為藥物總濃度。

醇質(zhì)體與脂質(zhì)體的Zeta 電位值、包封率結(jié)果見表2。由表2 可知，酮洛芬醇質(zhì)體的粒徑分布窄(PDI=0.17)，粒徑［(166.03 ±0.24)nm］顯著小于脂質(zhì)體(218.70±0.36)，這可能是由于高比例的乙醇引起，乙醇可以改變體系表面電荷，增加醇質(zhì)體的空間穩(wěn)定性，從而使粒徑減少。醇質(zhì)體粒徑小的特點有助于其進(jìn)行深層經(jīng)皮滲透。酮洛芬醇質(zhì)體和脂質(zhì)體的包封率由透析法測定，分別為(67.87 ±0.95)%和(94.50±0.26)%，這可能是由于醇質(zhì)體中加入乙醇使膜的流動性和滲透性增加，從而使包封率下降。

表2 酮洛芬不同載體粒徑、PDI、Zeta 電位值與包封率Table 2 Particle size，PDI，Zeta potential and encapsulation efficiency of different carrier

2.3 體外透皮實驗

2.3.1 離體小鼠皮的準(zhǔn)備 斷頸法處死小白鼠，由背底部開始，沿背部縱向用手術(shù)剪剪開小鼠背部皮膚，并環(huán)繞剪開，剝離小鼠皮膚后，剪去多余皮毛，除去其皮下組織，用刀片將剝離下的皮膚皮毛刮干凈，清水沖洗后再用少量生理鹽水清洗，并將處理好的小鼠皮放于生理鹽水中，4 ℃冰箱保存，24 h 內(nèi)使用。

2.3.2 體外透皮實驗 吸取6.5 mL 接受液于接受池中，用手術(shù)剪將已處理好的小鼠皮剪成適量大小，固定于供給室和接受池之間(注意使皮膚表層面向供給室，皮膚內(nèi)側(cè)面向接受室);分別量取酮洛芬乙醇溶液，酮洛芬脂質(zhì)體、酮洛芬醇質(zhì)體各2.5 mL 于供給室，將接受池置于恒溫水浴(32 ℃)中，開啟磁力攪拌器(200 r/min)。分別于0，0.5，1，2，3，5，7，9，12 h 取出0.2 mL 接收液，并及時補(bǔ)充等量恒溫的接收液。12 h 后，將皮膚取出并用純化水擦拭干凈，濾紙吸干皮膚多余水分，剪碎皮膚，用適量甲醇超聲，將取得的樣品分別對應(yīng)放入標(biāo)記好的彈頭試管中，經(jīng)處理后，按照2.1.1 節(jié)下的色譜條件測其藥物濃度，并根據(jù)下列公式計算累計滲透量(Q)。

Cn:不同取樣點時的接收液濃度;Ci:取樣點時取樣液濃度;V:接受池體積(mL);Vi:取樣體積(mL);A:擴(kuò)散面積(cm2)。

經(jīng)皮滲透12 h 后，酮洛芬脂質(zhì)體、醇質(zhì)體和乙醇溶液的累計滲透量結(jié)果見圖2 和表3。

圖2 體外透皮實驗Fig.2 Results of in-vitro percutaneous experiment

表3 12 h 后三種制劑的累計滲透量和皮膚滯留量Table 3 The cumulative permeation amount and skin retention of three formulations after 12 h

由圖2 和表3 可知，經(jīng)皮滲透12 h 后，皮膚累計滲透量由高到低依次為:酮洛芬醇質(zhì)體＞酮洛芬脂質(zhì)體＞酮洛芬乙醇溶液。醇質(zhì)體組的累計滲透量［(274.11 ±38.53)μg/cm2］顯著高于脂質(zhì)體和乙醇溶液組［(78.66±25.10)μg/cm2］(P ＜0.05)，但是脂質(zhì)體組［(128.10 ±30.68)μg/cm2］和乙醇溶液組間并無顯著性差異(P ＞0.05)。醇質(zhì)體組的皮膚滯留量也高于脂質(zhì)體組和乙醇溶液組，說明酮洛芬醇質(zhì)體與脂質(zhì)體相比，表現(xiàn)出了更好的經(jīng)皮滲透效果。

3 結(jié)論

醇質(zhì)體的促進(jìn)皮膚吸收機(jī)理目前仍不是很明確，但普遍認(rèn)為與乙醇的加入有關(guān)?？赡苁且驗橐掖几淖兞私琴|(zhì)層的排列而增加了脂質(zhì)分子的流動性，也可能是因為醇質(zhì)體在經(jīng)皮傳遞過程中發(fā)生了變形，從而通過紊亂的角質(zhì)層［5］。與普通脂質(zhì)體相比，醇質(zhì)體具有更好的包封率，穿透皮膚角質(zhì)層也顯著提升，但是乙醇濃度過高會破壞醇質(zhì)體的囊泡結(jié)構(gòu)，對醇質(zhì)體的形成不利，研究表明，當(dāng)醇質(zhì)體中乙醇的含量為30%時，制備的藥物包封率最高［6］。

醇質(zhì)體的粒徑對其在體內(nèi)的行為有很大的影響，通常認(rèn)為粒徑小于300 nm 的載體才能更容易地將藥物輸送到皮膚深部［7］。Zeta 電位值也可以衡量醇質(zhì)體的穩(wěn)定性，已有文獻(xiàn)表明，醇質(zhì)體因為乙醇的加入而帶負(fù)電荷，故醇質(zhì)體對陽離子型藥物的包封率較高［8］。

醇質(zhì)體包封率的測定方法一般有透析法和超速離心法。本論文采用透析法，避免了超速離心過程中因強(qiáng)大的能量引起的脂質(zhì)變形破裂造成的藥物流失［9］。醇質(zhì)體在貯存期間，包封率可能發(fā)生變化，這與醇質(zhì)體的穩(wěn)定性有關(guān)，時間過長可能因乙醇的揮發(fā)導(dǎo)致卵磷脂的析出致使藥物泄露。因此可以進(jìn)一步制成凝膠制劑來改善醇質(zhì)體的穩(wěn)定性，同時可加入適量的膽固醇增加膜的硬度，從而增加醇質(zhì)體的穩(wěn)定性，減低藥物的泄漏率［10］。關(guān)于酮洛芬醇質(zhì)體的穩(wěn)定性影響因素及透皮吸收的機(jī)制還需進(jìn)一步的研究。

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