張諧天，陶玉貴，楊良軍，鄭述翔，梁敏東

(安徽工程大學 生物與化學工程學院，安徽 蕪湖 241000)

納米材料在生物學領域的應用范圍十分廣泛，如藥物輸送、成像、治療、診斷以及接下來更進一步的發(fā)展，包括激活/失活、仿制和實現(xiàn)生物分子系統(tǒng)的功能［1］。這些功能都是基于納米材料獨特的物理和化學性質、尺寸大小等特點。但是納米粒子一旦進入生物系統(tǒng)中，就會與蛋白質之間相互反應，在納米粒子表面形成所謂的“蛋白質冠狀物”［2］。

近期研究中，納米粒子表面所形成的蛋白質冠狀物對于納米粒子的相關生物學影響已經被討論。目前，納米粒子與蛋白質的相互作用可以分為兩大類［3］:①納米粒子與單一的蛋白質的相互反應，即結合到納米粒子上的蛋白質種類已知;②納米粒子與數以百計的蛋白質組之間的相互反應。一旦納米材料與蛋白質相互作用之后，其表面的性質都會發(fā)生不定向性的改變［4］。

因此尋找到一個對蛋白質與納米粒子復合物的特性進行準確分析的技術方法和儀器尤其重要。Manmoudi 等［4］羅列出了研究影響蛋白質冠狀物形成因素的基本表征方法，Li 等［5］總結了納米粒子與不同蛋白質類型反應的動力學和熱力學表征方法。然而，針對蛋白質冠狀物的厚度、構象等方面的表征方法的總結相對較少。在此，將目前對蛋白質冠狀物各種參數的不同表征方法及其主要特點總結于表1 中，同時下文將會進一步詳細的討論每種表征方法。

表1 納米粒子與蛋白質相互作用的分析方法Table 1 Overview of analytical strategies to monitor NP-protein interaction

1 蛋白質冠狀物的物理參數

1.1 蛋白質冠狀物的密度與厚度

1.1.1 透射電子顯微鏡(TEM) TEM 以波長遠小于可見光的電子束作為光源，且電子束的波長與發(fā)射電子束的電壓平方根成反比，也就是說在高電壓的條件下，波長就會相對較短，所以其分辨率，就會相對較高，能夠觀察到光學顯微鏡下無法看清的小于0.2 nm 的細微結構。由于電子束的穿透能力非常微弱，所以當采用透射電子顯微鏡技術時，必須要注意電鏡標本的制作要求，即可在不損傷試樣原始組織的條件下［6］直接從納米或微米尺度的試樣中切取厚度為50 nm 左右的薄膜。如圖1［7］所示，N-琥珀酰殼聚糖與蛋白質的復合物的直徑通常為100～200 nm。

圖1 N-琥珀酰殼聚糖吸附BSA 之后的TEMFig.1 TEM morphology of NSCS loaded BSA N-琥珀酰殼聚糖濃度為0.5 mg/mL，BSA/N-琥珀酰殼聚糖的摩爾比30 ∶1

1.1.2 原子力顯微鏡(AFM) 原子力顯微鏡是一種可用來研究包括絕緣體在內的固體材料表面結構的分析儀器。由于其對工作環(huán)境的適應性非常強，如既可以在常溫常壓的條件下工作，也可以在液體環(huán)境中工作，所以其可以用來觀察SEM 和TEM 所不能觀察的樣品，如反應液中大分子的整體結構、具有生命特性的活體組織。AFM 可以提供納米粒子與蛋白質復合物的三維表面圖，且不需要對納米粒子與蛋白質復合物進行任何特殊處理，這樣就不會對復合物造成不可逆的轉變［8］。但是其運行的速度較慢，雖然能夠呈現(xiàn)出三維立體的樣品輪廓，但是其成像范圍卻非常有限。

1.2 蛋白質冠狀物的數量

1.2.1 離心分離 離心分離，是通過高速旋轉所產生的離心力對吸附到納米粒子上的蛋白質組進行分離的最基本方法。在離心過程中，必須注意以下幾點:①溶液體積的變化;②樣品的洗滌步驟;③樣品的洗滌時間。因為所形成的蛋白質冠狀物的厚度，表面形貌都取決于這些因素。但是在離心高分子量蛋白質或者蛋白質復合物時，通常會分不清蛋白質冠狀物在離心管中的位置［9］。

1.2.2 色譜法 尺寸排阻色譜技術(SEC)，也被稱為凝膠過濾層析法。由于待分離物質自身重量和體積的大小的不同，通過凝膠孔隙的時間也隨之不同，從而對其進行分離、純化。因此，SEC 也能夠檢測到蛋白質結合到納米粒子上的解離和吸附的程度。采用SEC 對碳富勒烯-蛋白質，二氧化硅納米粒子-蛋白質以及高分子蛋白質聚合物進行分離的已經報道出來了。除了分離蛋白質，SEC 也能夠檢測到在納米粒子與蛋白質相互反應過程中最佳的結合率和交換率［10］。離子交換色譜(IEC)包括陽離子交換色譜法和陰離子交換色譜法［11］，根據待測物自身所帶的凈電荷，不斷調整pH 值或者流動相的離子濃度來分別進行蛋白質、納米粒子以及納米粒子與蛋白質復合物的分離［12］。

1.2.3 電泳 毛細管電泳可以根據蛋白質的電荷和摩擦力分離蛋白質，分離的程度與結果通?？梢杂米贤饩€或者熒光檢測器來檢測［13］，不僅可以對吸附到納米粒子上的不同種類的蛋白質進行研究，如血漿蛋白、白蛋白等，而且可以使吸附蛋白質不需要經歷解吸過程就可以直接量化。然而，在分離過程中，一定要注意毛細管的內表面不能吸附有蛋白質，這樣就會嚴重影響到檢測的靈敏度［14］。凝膠電泳法是根據不同大小的蛋白質，其在電泳中的遷移率也隨之不同，所以垂直通過具有網狀結構的高分子聚丙烯酰胺凝膠的速度不一樣，從而得到分離，再將凝膠中的蛋白質用考馬斯藍或者硝酸銀等染料進行染色，通過密度檢測法來量化蛋白質豐度［15］。在納米粒子顆粒和單個的蛋白質相互作用反應體系中，1-CE 既可以用來純化納米粒子-蛋白質復合物，還可用來評估納米粒子與蛋白質的結合率［16］。而雙向凝膠電泳(2-DE)則可以根據不同蛋白質等電點［17］和分子量都不相同［18］的特點分離出大量(5 000)不同種類的蛋白質［13］。這兩種方法常用于測定納米粒子與蛋白質復合物的數量。

1.2.4 動態(tài)光散射(DLS) DLS 是一項基于納米粒子的光散射進行工作的，廣泛應用于待測樣品流體力學直徑測定的技術［19］。尺寸相似的蛋白質和納米粒子產生的散射光比較難以區(qū)分，因此，只有保證NPs 尺寸明顯大于蛋白質的尺寸(10 nm)［20］才能避免蛋白質和納米粒子的散射光相互混淆。DLS可以清楚的觀察到蛋白質冠狀物的形成過程，確定納米粒子與蛋白質復合物的流體動力學半徑的大小及其變化［21］。當蛋白質結合到納米粒子的表面上時，納米粒子的粒徑就會增大，當其表面結合的蛋白質達到飽和時，這種增大就會停止。因此，可以通過納米粒子尺寸增大的比例來間接測定蛋白質與納米粒子的結合率［22］，而且DLS 還可以通過Einstein-Stokes 方程測定出復合物的擴散常數:

式中，D 為擴散常數;kB為玻爾茲曼常數;T 為絕對溫度;η 為粘度;Rh為顆粒流體動力學半徑。

1.2.5 紫外吸收可見光譜(UV-vis spectroscopy)

紫外光譜見圖2。

圖2 NPs 與BSA 進行反應的紫外可見光譜的透射范圍Fig.2 Transmission spectra of gold NPs incubated with BSA measured by UV-Vis spectroscopy

紫外吸收可見光譜是基于待測樣品在紫外和可見光波長范圍內入射光(I0)與透射光(I1)比率的度量對其進行分析的，具有反應速度靈敏，操作過程簡單，且對樣品的制備要求較低等特點。納米粒子表面吸附的蛋白質誘導了吸收光譜發(fā)生如寬度和吸收峰的移動等變化，這些變化可以用來檢測納米粒子與蛋白質的結合率。但是樣品的吸收范圍會受到不同參數的影響而使量化難度增大，如反應物、濃度、pH 值以及環(huán)境的介電常數等，所以其量化程度一般。然而，對于那些符合朗伯-比爾定律的樣品，特別是濃度很低的時候，通過與單個成分相重疊的光譜范圍，可以得到吸附蛋白質的濃度。這個方法已經被用來研究碳納米管吸附BSA 的實驗中［23］。在AuNPs 吸附BSA 的研究中［22］，等離子峰出現(xiàn)了紅移和寬度擴大，證明了BSA 的吸附量發(fā)生了一定的轉變。

2 蛋白質冠狀物的化學參數

2.1 蛋白質冠狀物的種類

2.1.1 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜分析

(MALDI-TOF-MS) 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)是一個通過檢測磷蛋白降解產生的磷酸肽來分析蛋白質磷酸化作用的有效工具［20］，確定蛋白質與NPs 是否結合。蛋白質通過一個蛋白酶被切除和消化，碎片可以用MALDI-TOFMS 分析出來，然后在蛋白質數據庫中搜尋肽質量指紋譜來確定蛋白質的種類。對于結合到納米粒子與上的蛋白質的確定，通常采用以下兩種方法:首先，使蛋白質從納米粒子表面釋放出來，如使用表面活性劑等［24］，然后通過電泳將其分離出來。第二種方法是就地純化的納米粒子與蛋白質復合物，然后通過LC/MS 分離和分析。如圖3 所示［25］，MALDITOF-MS 成功的發(fā)現(xiàn)了樣品中獨特的多肽。

圖3 基質輔助激光解析電離飛行時間質譜(A)核纖層蛋白Alelta10;(B)核纖層蛋白AFig.3 MALDI-TOF spectrum of (A)lamin Adelta10，(B)lamin A

2.1.2 N 端微量測序 N 端微量測序是從蛋白質/多肽N-末端按順序切割下來，通常為含有10 ～30個N 端氨基酸殘基，且易形成穩(wěn)定的多肽序列用于分析鑒定。同時還可以通過蛋白質數據庫來識別結合到納米粒子上的蛋白質［26］。雙向凝膠電泳中的蛋白質可以通過自動氣相測序器來測定自身氨基酸序列［27］。該技術的主要缺點就是當氨基酸的N 端被化學修飾或者是它隱藏在蛋白質內部的時候D端微量測定技術就不會起作用了。此外，由于該方法需要蛋白質純度的識別效率較高，所以要與雙向凝膠電泳一起使用［28］。

2.2 蛋白質冠狀物的構象

蛋白質和納米粒子之間的相互作用可能會引起蛋白質構象的變化，而這些變化又可能會產生未知抗原以及蛋白質功能的轉變。所以，檢測當納米粒子與蛋白質相互反應時的蛋白質的構象的變化是生物學中一個重要的研究方向。分析的方法通常使用傅里葉變換紅外光譜(FTIR)、拉曼光譜、熒光光譜和圓二色性光譜(CD)。

2.2.1 紅外(FTIR)和拉曼光譜 紅外光譜和拉曼光譜在測定蛋白質構象變化的過程中是相輔相成的，不僅可以確定蛋白質是否結合到納米粒子的表面，還可以檢測納米粒子與蛋白質復合物的表面特性。對于紅外光譜，蛋白質的二級結構可以通過酰胺鍵的吸收率來計算。在酰胺Ⅰ，Ⅱ和Ⅲ帶中，酰胺Ⅰ振動譜帶(1 700 ～1 600 cm－1)是最敏感的區(qū)域，這個區(qū)域最適合確定蛋白質的構象。Noinville等［29］課題組利用BSA 吸附在載體表面時構象改變對自身親水性、疏水性的影響。如圖4 所示［30］，從紅外光譜中可以看出不同摩爾比的BSA 與AgNP 反應時，酰胺Ⅰ帶和酰胺Ⅱ帶振動峰值的區(qū)別。

Samir 等［31］利用拉曼光譜分別測定了溶菌酶和α-乳白蛋白吸附在反相作用色譜介質上的構象變化。蛋白質的拉曼光譜中展現(xiàn)的吸收帶主要由三部分構成:①多肽主鏈;②芳香族側鏈;③含硫的側鏈。拉曼光譜較紅外光譜有兩大優(yōu)勢:①拉曼光譜可以測量水溶液中納米粒子與蛋白質的復合物;②操作簡單易懂，測量光譜區(qū)域不受局限。

圖4 4 種不同摩爾比的BSA 和AgNP 在25 ℃條件下的FTIR 光譜Fig.4 FTIR spectra of BSA at four different molar ratio of BSA to AgNP at 25 ℃temperature

2.2.2 熒光光譜 因為許多重要的生物反應過程如蛋白質構象的變化、蛋白質側鏈的旋轉運動以及分子之間的結合的時間僅僅只需要幾秒鐘時間，然而這短短幾秒中也正好是被激發(fā)的熒光狀態(tài)維持的時間［32］，所以熒光光譜不僅可以測量結合位點的數量、結合常數以及蛋白顆粒結合的協(xié)同程度(希爾常數)［33］，同時對蛋白質結構變化的測定也非常靈敏。

蛋白質是由氨基酸構成的大分子結構，在構成蛋白質的眾多氨基酸種類中，部分氨基酸自身就含有熒光素，如絡氨酸、色氨酸以及苯丙氨酸。在納米粒子與蛋白質相互作用的過程中，NPs 或者蛋白質至少其中一個必須含有內在熒光素。如若不然，則必須向該反應體系中加入外源熒光素。因為納米粒子與蛋白質之間的相互反應通常會改變熒光素本身的化學環(huán)境，甚至是自身的結構，這就會改變蛋白質的熒光性，導致蛋白質發(fā)生動態(tài)/靜態(tài)熒光猝滅。一旦蛋白質發(fā)生熒光猝滅，光譜中的熒光強度就會減弱，原本的發(fā)射峰就會發(fā)生偏移，同時也可以根據熒光個向異性法(FA)［34］和熒光共振能量轉移［35］來共同證明納米粒子與蛋白質發(fā)生了相互作用。如果熒光猝滅效應是由碰撞引起的，熒光團的生命周期也將減少［29］。熒光強度猝滅的周期遵循Stern-Volmer 的關系:

式中，F(xiàn)0，F(xiàn) 分別代表初始和修飾之后的熒光強度;τ0代表周期;Ksv是Stern-Volmer 常數;［Q］是猝滅濃度［36］。

在多功能蛋白質與多壁碳納米管相互作用的實驗中，此方程被用來表明親和力是取決于納米管的直徑、表面化學性質和蛋白質類型，Shang 等［37］課題組通過不同pH 值的反應體系中BSA 的熒光發(fā)射光譜的不同證明了BSA 的構象會受到反應體系中不同pH 值的影響，見圖5。

圖5 BSA 的熒光發(fā)射光譜Fig.5 Fluorescence emission spectra of BSA

2.2.3 圓二色性光譜(CD) 不同的蛋白質二級結構(α-螺旋，β-折疊)在CD 光譜的紫外區(qū)域都有著自己的特點，所以圓二色性光譜法已經廣泛用于檢測結合到納米粒子上的蛋白質的構象變化［38］。然而，CD 通常反應的是整個分子的平均值，所以即使CD 可以測定出一個蛋白質含有50 個α-螺旋，但是也不能確定哪個特定的氨基酸殘基參與了α-螺旋的形成。另一個不足就是在200 nm 左右的高吸收能量區(qū)域可能會降低測量的準確度。因此，蛋白質二級結構百分比的計算通常是采用在長波長(＞200 nm)區(qū)域內收集的數據［39］。Su 等［40］通過CD光譜，在不同pH 值的條件下，研究了碳納米管表面不同的多肽的構象變化，發(fā)現(xiàn)在接近中性pH 值的范圍內，結合到碳納米管上的UW-1 的β 折疊結構發(fā)生變形，而蛋白質B3的α 螺旋構象并沒有改變。

3 結束語

特殊化學和物理性能的納米材料在生物醫(yī)學領域的研究飛速增長，但對于其自身毒性以及應用的安全性研究仍處于起步階段，而且目前的研究大部分都是集中在蛋白質與納米顆粒之間短時的相互作用，這些相互作用包括蛋白質冠狀物的形成，細胞直接的接觸，粒子在細胞表面的結合、內吞以及進入細胞內的反應過程等方面。因此仍然需要大量的科學研究以及更多的分析技術和方法來更好的了解納米材料與生物系統(tǒng)相結合的界面發(fā)生的變化，從而深入了解納米材料-蛋白質相互作用的機理，全面認識納米材料毒性問題，客觀評價納米材料-蛋白質之間復雜的相互作用。

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