孔銘顥， 毛明偉， 肖亞賢， 唐貞力

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院急診科,上海 200072;2. 云南省臨滄市人民醫(yī)院急診危重病科,云南 臨滄 677000)

?

·基礎(chǔ)研究·

非受體酪氨酸蛋白激酶Lck與IL-17在急性肺損傷大鼠模型中的表達(dá)及意義

孔銘顥1， 毛明偉2， 肖亞賢2， 唐貞力2

(1. 同濟(jì)大學(xué)附屬第十人民醫(yī)院急診科,上海 200072;2. 云南省臨滄市人民醫(yī)院急診危重病科,云南 臨滄 677000)

目的 研究非受體酪氨酸蛋白激酶Lck與IL-17在急性肺損傷(ALI)炎癥反應(yīng)中的表達(dá)及意義。方法 氣管 內(nèi)滴入鹽酸法復(fù)制大鼠ALI模型，用免疫組織化學(xué)方法(IHC)檢測肺組織中Lck和IL-17蛋白表達(dá)水平；Western印跡法檢測肺組織勻漿中Lck蛋白的表達(dá)；用酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測肺組織勻漿和肺泡灌洗液(BALF)中IL-17的含量。結(jié)果 正常大鼠肺組織中Lck與IL-17低水平表達(dá)，ALI模型建立后6h，其表達(dá)顯著增高，肺間質(zhì)中陽性著色的單核細(xì)胞明顯增多。與對照組比較，ALI組大鼠肺組織勻漿和肺泡灌洗液(BALF)中 IL-17含量均顯著升高[(102.04±14.23)pg/mg provs. (25.16±9.08)pg/mg pro,P<0.01;(66.46±13.12)pg/mg provs. (8.19±2.54)pg/mg pro,P<0.01]。結(jié)論 ALI大鼠肺組織、肺泡灌洗液、勻漿中Lck與IL-17的表達(dá)均上調(diào)，兩者參與了ALI的炎癥反應(yīng)過程。

急性肺損傷; IL-17; 非受體酪氨酸蛋白激酶Lck; 大鼠

急性肺損傷(acute lung injury, ALI)的主要病理特征為多種炎性細(xì)胞參與的炎癥反應(yīng)，中性粒細(xì)胞是其中主要的炎性細(xì)胞。該細(xì)胞通過釋放多種蛋白酶、超氧化物等在ALI發(fā)病中發(fā)揮重要作用[1]。細(xì)胞因子-17(Interleukin-17, IL-17)主要是由活化的Th17淋巴細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子，它能刺激多種炎性細(xì)胞分泌IL-6、IL-8、單核細(xì)胞趨化蛋白1等炎癥介質(zhì)，并增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)黏附分子-1(Interlcellular adhesion molecule, ICAM-1)的表達(dá)，是中性粒細(xì)胞的一種特殊的激活物[2-3]。

非受體酪氨酸激酶Src家族中的Lck是在T細(xì)胞受體(T cell receptor, TCR)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中起關(guān)鍵作用的激酶[4]。在Lck激酶的作用下，引起胞內(nèi)的一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終使T細(xì)胞被激活[5]，分泌各種細(xì)胞因子、炎癥介質(zhì)、黏附因子，進(jìn)一步激活其他免疫細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)。

在ALI的炎癥反應(yīng)過程中，Lck與IL-17的表達(dá)有什么變化及意義，目前尚無相關(guān)報道。本研究以ALI大鼠為研究對象，探討Lck與IL-17在ALI的炎癥反應(yīng)過程中的變化及可能的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

小鼠IL-17 ELISA檢測試劑盒(Diaclone公司),小鼠Lck抗體(ab18896， abcam公司)，小鼠IL-17抗體(ab79056， abcam公司)，RIPA細(xì)胞裂解液(P0013B，碧云天)。

1.2 動物模型制作和分組

健康成年SD大鼠20只(購自同濟(jì)大學(xué)實(shí)驗動物中心)，200～250g，隨機(jī)分為鹽酸吸入組10只，對照組10只。(1) 鹽酸吸入組(ALI組): 大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔內(nèi)注射(40mg/kg)，麻醉滿意后行氣管切開插管固定，將鹽酸(0.1mol/L，2ml/kg)滴入氣道內(nèi)并左右側(cè)臥位各5min，觀察大鼠呼吸頻率變化、發(fā)紺情況。鹽酸吸入后6h結(jié)束實(shí)驗。(2) 對照組: 正常飼養(yǎng)，不做任何處理。

1.3 標(biāo)本制作及檢測指標(biāo)

1.3.1 支氣管肺泡灌洗(Bronchoalveolar lavage fluid, BALF) 于實(shí)驗結(jié)束后放血處死大鼠，開胸結(jié)扎右主支氣管，用4℃生理鹽水2ml反復(fù)灌注左主支氣管并回抽，回收率60%～80%。將灌洗液在3000r/min轉(zhuǎn)速下離心10min，離心半徑12cm，上清液分裝并保存在-20℃冰箱中待測。

1.3.2 Western Blot檢測Lck蛋白 取稱重量后的右上肺組織按照每100mg組織加RIPA蛋白裂解液1ml進(jìn)行冰浴勻漿，充分勻漿后轉(zhuǎn)移到預(yù)冷的4℃ EP管中。以4℃10000r/min進(jìn)行低溫離心20min，取上清液即為組織蛋白提取物。取5μg肺組織蛋白提取物進(jìn)行12%SDS-PAGE，樣品經(jīng)SDS-PAGE分離后恒壓60V轉(zhuǎn)移3h；轉(zhuǎn)移后的PVD膜浸入含3%脫脂奶粉的PBS-T中封閉2h；再將膜浸入1∶500稀釋的兔抗大鼠Lck中，4℃過夜；洗膜3次，加1∶1500稀釋的二抗，室溫反應(yīng)60min，洗滌后以DAB顯色試劑盒顯色，拍照。

1.3.3 組織病理學(xué)檢測 各組大鼠均取右肺中葉，標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林充分固定，常規(guī)石蠟包埋，每個標(biāo)本連續(xù)切片3張，一張做常規(guī)蘇木精-伊紅(HE)染色觀察肺組織的病理改變，對應(yīng)的另兩張分別做免疫組織化學(xué)，觀察肺組織中Lck、IL-17的表達(dá)情況。切片厚度4μm。采用SP法免疫組織化學(xué)染色，一抗: 兔抗鼠Lck單克隆抗體，按1∶100稀釋；一抗: 兔抗鼠IL-17多克隆抗體，按1∶100稀釋。

1.3.4 肺組織勻漿液的制作 稱取右下葉肺組織并搗碎，按質(zhì)量: 體積比1∶9加4℃生理鹽水，充分勻漿，3000r/min，離心10min，離心半徑12cm，取上清液保存在-20℃冰箱中待測。

1.3.5 肺組織勻漿、BALF液中IL-17的測定 用同一方法對肺組織勻漿、BALF液做IL-17測定。小數(shù)肺組織、BALF液分別離心、收集上清液，以ELISA法檢測細(xì)胞因子IL-17的含量。嚴(yán)格參照ELISA試劑盒說明書完成實(shí)驗，在450nm處測吸光值。結(jié)果計算與判斷: 所有OD值都應(yīng)減除空白值后再行計算。以標(biāo)準(zhǔn)品1000、500、250、125、62.5、31.25、15.625、0ng/ml之OD值在半對數(shù)紙上作圖，畫出標(biāo)準(zhǔn)曲線。根據(jù)樣品OD值在該曲線圖上查出相應(yīng)小鼠IL-17的含量。IL-17測定結(jié)果均以每毫克蛋白所含量表示 (pg/mg pro)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 大鼠肺組織病理

對照組大鼠肺組織HE染色見支氣管、肺組織結(jié)構(gòu)完整，肺泡腔清晰，肺泡間隔無水腫及炎性細(xì)胞浸潤等改變(圖1A)。ALI組大鼠出現(xiàn)明顯的肺損傷改變: 肺泡壁水腫、肺間質(zhì)增厚和肺泡腔內(nèi)有大量炎性細(xì)胞浸潤，如嗜酸性粒細(xì)胞,淋巴細(xì)胞等，肺泡結(jié)構(gòu)破壞(圖1B)。

圖1 大鼠肺組織HE染色；[A]正常對照組，[B]急性肺損傷組(×200倍)Fig.1 H-E staining of rat lung tissues.[A] Normal control[B] acute lung injury(×200)

2.2 Lck免疫組織化學(xué)染色

對照組大鼠肺組織內(nèi)有少量Lck表達(dá)，主要分布在小支氣管、細(xì)支氣管氣道上皮組織中，見圖2A。ALI組大鼠肺組織內(nèi)Lck表達(dá)增高，主要分布在氣道上皮組織、增厚的肺間質(zhì)和被破壞的肺泡壁中，見圖2B。

圖2 大鼠肺組織Lck染色；[A]正常對照組，[B]急性肺損傷組(×200倍)Fig.2 H-E staining of rat lung tissues.[A] Normal control[B] acute lung injury(×200)

2.3 IL-17免疫組織化學(xué)染色

對照組大鼠肺組織內(nèi)有少量IL-17表達(dá)，主要分布在肺泡上皮細(xì)胞、肺間質(zhì)內(nèi)單核細(xì)胞，見圖3A。ALI組大鼠IL-17表達(dá)明顯增高，主要分布在增厚的肺間質(zhì)單核細(xì)胞內(nèi)，見圖3B。

圖3 大鼠肺組織IL-17染色；[A]正常對照組，[B]急性肺損傷組(×200倍)Fig.3 IL-17 staining of rat lung tissues. [A] Normal control [B] acute lung injury(×200)

2.4 大鼠肺組織勻漿Lck蛋白的檢測

Western Blot結(jié)果顯示，與對照組相比較，ALI組大鼠肺組織勻漿中Lck表達(dá)明顯上調(diào)，見圖4。

圖4 肺組織勻漿中Lck蛋白Western Blot檢測結(jié)果Fig.4 Western blotting results of Lck in lung homogenate

2.5 大鼠肺組織勻漿、BALF液中IL-17的檢測

ALI組大鼠肺組織勻漿、BALF液中IL-17含量明顯升高，與對照組相比較，結(jié)果有顯著差異(P<0.01)，見表1、圖5。

表1 肺組織勻漿及BALF中IL-17的含量

Tab.1 The level of IL-17 in lung homogenate and BALF

分類ALI組(n=10)對照組(n=10)tP肺組織勻漿102.03±14.23**25.16±9.087.4670.008BALF66.46±13.12*8.19±2.548.3820.009

注: IL白細(xì)胞介素，BALF肺泡灌洗液,ALI急性肺損傷。與對照組相比，*P<0.01,**P<0.01

圖5 肺組織勻漿、BALF液中IL-17的檢測結(jié)果柱狀圖Fig.5 IL-17concentration in lung homogenate and BALF

3 討 論

ALI是由多種不同原因引起的肺泡上皮、肺泡毛細(xì)血管內(nèi)皮和肺間質(zhì)的急性彌漫性損害，以急性進(jìn)行性加重的呼吸窘迫、難治性低氧血癥和非心源性肺水腫為表現(xiàn)[6]。T淋巴細(xì)胞在肺的微循環(huán)中介導(dǎo)的免疫反應(yīng)ALI病理組織學(xué)上的一項標(biāo)志性改變，其不斷釋放氧自由基、蛋白酶及多種細(xì)胞因子，成為推動病變發(fā)生發(fā)展的重要環(huán)節(jié)[7]。

Th17細(xì)胞是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一類CD4+輔助性T細(xì)胞，在介導(dǎo)炎性反應(yīng)、自身免疫性疾病、腫瘤和移植排斥等方面發(fā)揮重要作用。Th17細(xì)胞主要分泌IL-17(包括IL-17A、IL-17F)、IL-22、IL-23、IL-6、TNF-α等炎性介質(zhì)和因子[8]。IL-17是Th17細(xì)胞分泌的主要細(xì)胞因子，其重要的生物學(xué)功能是促進(jìn)多種細(xì)胞釋放炎癥因子而發(fā)揮著促進(jìn)炎癥反應(yīng)的發(fā)生發(fā)展、免疫應(yīng)答等功能[9]。目前Th17細(xì)胞參與ALI炎癥反應(yīng)的具體作用機(jī)制尚不清楚。有研究表明，IL-17可誘導(dǎo)嗜酸粒細(xì)胞活化，使其釋放細(xì)胞因子和趨化因子CXCL1、CXCL8、CCL4而介導(dǎo)免疫反應(yīng)[8]。IL-17與中性粒細(xì)胞的募集、活化密切相關(guān)，是聯(lián)系T細(xì)胞與中性粒細(xì)胞的重要介質(zhì)[10]。另外，IL-17可通過誘導(dǎo)支氣管、肺泡內(nèi)幾種潛在的趨化因子，特別是IL-8的釋放，間接趨化中性粒細(xì)胞在肺組織中的聚集和激活，參與氣道炎癥的反應(yīng)過程[11]。在本研究中，肺組織勻漿及肺泡灌洗液中IL-17均增高,進(jìn)一步證明了這一結(jié)論。但I(xiàn)L-17對中性粒細(xì)胞是否具有直接的刺激、激活作用，尚需進(jìn)一步研究證實(shí)。

Lck是非受體酪氨酸蛋白激酶Src家族中的一員。在免疫防御過程中，Lck通過與TCR相互作用引起T淋巴細(xì)胞內(nèi)的一系列信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，最終使T淋巴細(xì)胞被激活、成熟，向不同亞群分化，產(chǎn)生IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-9、IL-10、IL-13、IL-17等細(xì)胞因子，進(jìn)一步激活其他免疫細(xì)胞釋放各種炎癥介質(zhì)、黏附因子等，導(dǎo)致局部炎癥反應(yīng)[12]。因此，在T細(xì)胞的活化、成熟過程中Lck發(fā)揮著重要作用。本研究實(shí)驗結(jié)果顯示，ALI時肺組織中IL-17表達(dá)增高的同時，Lck的表達(dá)也增高，提示Lck也可能參與了Th17細(xì)胞的活化過程，促進(jìn)Th17細(xì)胞釋放細(xì)胞因子。

綜上所述，本次研究以氣管內(nèi)吸入鹽酸法制作大鼠ALI模型，發(fā)現(xiàn)ALI大鼠肺組織勻漿中Lck表達(dá)明顯上調(diào)，并且肺組織勻漿、BALF液中IL-17含量明顯升高，可以肯定在大鼠鹽酸吸導(dǎo)致的ALI中IL-17是增高的，與國內(nèi)其他學(xué)者的研究結(jié)果相近[8,12]。Lck與IL-17之間可能存在某種相關(guān)性，兩者均參與了ALI的復(fù)雜病理過程，且相互作用，相互影響，加重了ALI的炎癥反應(yīng)。但是ALI是一個復(fù)雜的免疫防御過程，有多種免疫活性細(xì)胞參與發(fā)病過程，Lck與IL-17在其中的具體作用機(jī)制以及與其他免疫細(xì)胞的相互作用，需進(jìn)一步的研究和探討。隨著對IL-17研究的不斷加深，將促進(jìn)人們對其效應(yīng)功能更全面的認(rèn)識，為ALI的發(fā)病機(jī)制和防治對策提供新的認(rèn)識。

[1] 李百玲,柴家科,段紅杰,等.肺泡Ⅱ型上皮細(xì)胞在急性肺損傷/急性呼吸窘迫綜合征中的研究進(jìn)展[J].中華損傷與修復(fù)雜志: 電子版，2014,(3): 323-325.

[2] 劉麗娟,于英瑤,王琪,等.慢性蕁麻疹患者血清IL-4、IL-17、IL-23與IFN的表達(dá)水平及臨床意義[J].寧夏醫(yī)學(xué)雜志，2014，(9): 820-821.

[3] 彭清,溫雪萍,顏志軍,等.COPD患者TH17細(xì)胞的表達(dá)及糖皮質(zhì)激素的調(diào)節(jié)作用[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報: 醫(yī)學(xué)版,2012，33(6): 22-26.

[4] 張偉金,郭曉華.非受體型酪氨酸蛋白激酶介導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞通透性改變的研究進(jìn)展[J].微循環(huán)學(xué)雜志，2014，(1): 61-64.

[5] 盛薇薇,邵宗鴻.T細(xì)胞活化銜接因子在T淋巴細(xì)胞活化過程中作用[J].中華醫(yī)學(xué)雜志，2013，93(8): 631-633.

[6] 丁崗強(qiáng),康誼,劉俊平，等.甘草甜素對膿毒癥小鼠急性肺損傷保護(hù)作用的實(shí)驗研究[J].中華醫(yī)院感染學(xué)雜志，2014，(19): 4742-4744.

[7] 苑建房.烏司他丁對急性肺損傷患者T淋巴細(xì)胞免疫功能的影響[J].河北醫(yī)藥,2012，(9): 1313-1314.

[8] 謝麗萍,李建強(qiáng),朱文玲,等.白介素17在脂多糖致大鼠急性肺損傷中的表達(dá)及地塞米松的影響[J].國際呼吸雜志，2013，33(3): 192-196.

[9] 周宏斌,陳志華,李雯.Th17細(xì)胞及白細(xì)胞介素17A在慢性氣道炎癥性疾病中的作用[J].中國病理生理雜志，2012，28(3): 560-564.

[10] 唐海成,柏宏堅,姜永前,等.慢性阻塞性肺疾病患者血漿白介素-17、C反應(yīng)蛋白的表達(dá)及相關(guān)性研究[J].江蘇大學(xué)學(xué)報: 醫(yī)學(xué)版,2013.23(4): 325-327.

[11] 張維,王新衛(wèi),劉新年.68例支氣管哮喘患者中Th17和Treg聯(lián)合檢測的臨床意義[J].重慶醫(yī)學(xué)，2013，42(14): 1583-1584,1588.

[12] 謝麗萍,李建強(qiáng),朱文玲,等.白介素17在脂多糖致大鼠急性肺損傷中的表達(dá)及地塞米松的影響[J].國際呼吸雜志,2013，33(3): 192-196.

The expression of non-receptor tyrosine protein kinase Lck andIL-17 in rats with acute lung injury

KONGMing-hao1,MAOMing-wei2,XIAOYa-xian2,TANGZhen-li2

(1. Dept. of Emergency, Tenth People’s Hospital, Tongji University, Shanghai 200072, China; 2. Dept. of Emergency, Lincang People’s Hospital, Dali College, Yunnan Lincang 677000, China)

Objective To investigate the expression of non-receptor tyrosine protein kinase Lck and IL-17 in acute lung injury(ALI). Methods ALI was induced by inhalation of hydrochloric acid into trachea in rats. Immunohistochemistry was applied to detect the expression of Lck and IL-17 in lung tissue. The expression of Lck in lung homogenate was measured by Western blot. The concentrations of IL-17 in lung homogenate and bronchoveolar lavage fluid(BALF) were detected by ELISA. Results Lck and IL-17 were expressed at lower level in lungs of normal rats. The levels of Lck and IL-17 were significantly increased 6h after HCI inhalation. The increase of Lck and IL-17-positive mononuclear cells were also found in lung interstitium. The IL-17 levels in lung tissue homogenate and in BALF were higher in ALI group than those in control group [(102.04±14.23)pg/mg provs. (25.16±9.08)pg/mg pro,P<0.0l;(66.46±13.12)pg/mg provs.(8.19±2.54)pg/mg pro,P<0.0l]. Conclusion The expression of Lck and IL-17 in lung tissue and BALF is up-regulated in ALI rat, indicating that both may be in the inflammatory response of ALI.

acute lung injury； IL-17; no receptor tyrosine protein kinase Lck; rat

10.16118/j.1008-0392.2015.03.006

2014-11-07

孔銘顥(1977—)，男，主治醫(yī)師,碩士.E-mail: flashkh77@126.com

唐貞力.E-mail: spakledoctor@126.com

R 561.4

A

1008-0392(2015)03-0027-04