趙 靜， 林 超， 潘衛(wèi)慶

(同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092)

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·基礎(chǔ)研究·

日本血吸蟲(chóng)機(jī)械脫尾童蟲(chóng)體外轉(zhuǎn)染siRNA的效率研究

趙 靜， 林 超， 潘衛(wèi)慶

(同濟(jì)大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，上海 200092)

目的 比較體表滲透法、電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑LipofectamineTM2000以及納米材料聚乙烯亞胺(PEI)4種不同的方法用于日本血吸蟲(chóng)機(jī)械脫尾童蟲(chóng)體外轉(zhuǎn)染siRNA的轉(zhuǎn)染效率，以期篩選理想的轉(zhuǎn)染方法。 方法 選用攜帶有紅色熒光標(biāo)記的化學(xué)合成siRNA,并且據(jù)根不同轉(zhuǎn)染方法說(shuō)明步驟優(yōu)化體外轉(zhuǎn)染條件，分別轉(zhuǎn)染日本血吸蟲(chóng)機(jī)械脫尾童蟲(chóng)。在一定的時(shí)間內(nèi)利用熒光顯微鏡觀察蟲(chóng)體轉(zhuǎn)染情況并計(jì)陽(yáng)性蟲(chóng)數(shù)，并應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(RT-PCR)技術(shù)檢測(cè)轉(zhuǎn)入靶基因的mRNA表達(dá)情況。結(jié)果 經(jīng)過(guò)體外轉(zhuǎn)染條件的優(yōu)化，電穿孔和納米材料介導(dǎo)的siRNA轉(zhuǎn)染效率達(dá)到了90%以上。應(yīng)用RT-PCR驗(yàn)證，4種方法中，電穿孔轉(zhuǎn)染法和納米材料轉(zhuǎn)染的siRNA對(duì)靶基因有顯著的抑制效應(yīng)(P<0.05)，電穿孔法轉(zhuǎn)染抑制率達(dá)(45±9.63)%，納米材料轉(zhuǎn)染抑制率達(dá)(37±6.17)%。結(jié)論 除了常規(guī)的電穿孔法，納米材料作為新型的轉(zhuǎn)染載體，能夠有效地傳遞siRNA進(jìn)入血吸蟲(chóng)童蟲(chóng)體內(nèi)，干擾目的基因的表達(dá)，這將為日本血吸蟲(chóng)功能基因?qū)W的研究提供高效的轉(zhuǎn)染工具。

日本血吸蟲(chóng)； 機(jī)械脫尾童蟲(chóng)； siRNA; 轉(zhuǎn)染效率

血吸蟲(chóng)病(Schistosomiasis)是由于血吸蟲(chóng)寄生于人體引起的熱帶病,這是嚴(yán)重危害人類(lèi)健康的寄生蟲(chóng)病之一。它主要流行于全球75個(gè)國(guó)家和地區(qū)，分布在亞洲、非洲和拉丁美洲。據(jù)統(tǒng)計(jì)，目前全球仍約有2.5億人和大量的家畜感染血吸蟲(chóng)病[1]。其中危害最為嚴(yán)重的血吸蟲(chóng)包括日本血吸蟲(chóng)、曼氏血吸蟲(chóng)和埃及血吸蟲(chóng)，在我國(guó)流行的為日本血吸蟲(chóng)(Schistosomajaponicum)。血吸蟲(chóng)具有復(fù)雜的生活史，其基因表達(dá)具有期特異性，以適應(yīng)其復(fù)雜的生長(zhǎng)時(shí)期轉(zhuǎn)換和宿主轉(zhuǎn)換；然而，血吸蟲(chóng)生長(zhǎng)發(fā)育及其期特異基因表達(dá)的調(diào)控機(jī)制尚不清楚。近年來(lái),RNA干擾(RNAi)已被廣泛用于探索基因功能和傳染性疾病及惡性腫瘤的治療領(lǐng)域[2]。一些功能基因，在活體動(dòng)物實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證其功能之前，首先要在體外個(gè)體水平上進(jìn)行功能性研究，這就需要將功能siRNA導(dǎo)入目的活體。常用的轉(zhuǎn)染方法有浸泡法、慢病毒法、電穿孔法、脂質(zhì)體法等[3]。浸泡法需要高劑量siRNA試劑，成本比較高。病毒轉(zhuǎn)染，雖適用于大多數(shù)細(xì)胞類(lèi)型，但該方法對(duì)操作的安全性要求較高，且質(zhì)粒構(gòu)建及病毒的包裝、收集和濃縮等過(guò)程比較繁瑣。物理介導(dǎo)方法中最常用的是電穿孔法，該方法適用范圍比較廣，需要特殊的電轉(zhuǎn)儀器，但造成的細(xì)胞機(jī)械損傷很高，不同的細(xì)胞類(lèi)型轉(zhuǎn)染所需要的電轉(zhuǎn)參數(shù)也不同[4]。商品化的脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑用于細(xì)胞系的轉(zhuǎn)染效果比較好，但在血吸蟲(chóng)的蟲(chóng)體中轉(zhuǎn)染效率比較低。因此，選取轉(zhuǎn)染效率高、細(xì)胞毒性小、操作簡(jiǎn)便的轉(zhuǎn)染試劑，對(duì)于血吸蟲(chóng)的基因功能研究至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)將新型納米材料-陽(yáng)離子聚合物聚乙烯亞胺(polyethyl-enimine，PEI)介導(dǎo)siRNA轉(zhuǎn)染技術(shù)引入到日本血吸蟲(chóng)機(jī)械脫尾童蟲(chóng)的轉(zhuǎn)染中，為建立高效、方便的血吸蟲(chóng)轉(zhuǎn)染方法打下了基礎(chǔ)，進(jìn)而為血吸蟲(chóng)的功能基因?qū)W研究提供有效的分析工具。

1 材料與方法

1.1 蟲(chóng)株

日本血吸蟲(chóng)(中國(guó)大陸株)尾蚴由中國(guó)疾病預(yù)防控制中心寄生蟲(chóng)病預(yù)防控制所釘螺室提供。

1.2 主要試劑與儀器

根據(jù)Basch的配方[5]制備M169培養(yǎng)基，高壓過(guò)濾器過(guò)濾，-20℃保存?zhèn)溆?；胎牛血清?gòu)自Gibco公司，用時(shí)按照10%添加；膽固醇及熒光標(biāo)記siRNA及陰性對(duì)照小RNA購(gòu)自廣州銳博生物公司；陽(yáng)離子脂質(zhì)體lipofectamineTM2000(Lipo2000)；聚乙烯亞胺(PEI)[6]由同濟(jì)大學(xué)納米學(xué)院林超教授課題組制備,去離子蒸餾水稀釋至1mg/ml的工作液；Genepluser XceU電轉(zhuǎn)儀(Bio-Rad)；倒置熒光顯微鏡(Nikon公司)。

1.3 機(jī)械童蟲(chóng)培養(yǎng)

由釘螺室提供的新鮮尾蚴，經(jīng)貼片法收集尾蚴，置4℃?zhèn)溆?。根?jù)John等[1]的機(jī)械轉(zhuǎn)變方法處理收集好的尾蚴。尾蚴經(jīng)機(jī)械斷尾方法轉(zhuǎn)變?yōu)闄C(jī)械童蟲(chóng)(Schistosomula)[7]，在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)孵育3h，即可用于轉(zhuǎn)染，完成轉(zhuǎn)染后的機(jī)械童蟲(chóng)轉(zhuǎn)移至6孔板中，置2ml的M169培養(yǎng)液中體外繼續(xù)培養(yǎng)，每孔約1000條童蟲(chóng)，加入100U/ml抗生素(青霉素/鏈霉素)，轉(zhuǎn)染前2d無(wú)血清培養(yǎng)(37℃、5%CO2培養(yǎng)箱)；每隔1d進(jìn)行半量更新培養(yǎng)液，置換培養(yǎng)基前，將新鮮培養(yǎng)基置CO2培養(yǎng)箱內(nèi)預(yù)溫 0.5h。

1.4 轉(zhuǎn)染方法

1.4.1 體表滲透法 轉(zhuǎn)染前，將機(jī)械童蟲(chóng)以500條/孔接種于24孔板中，添加無(wú)血清新鮮的M169培養(yǎng)基496μl，向培養(yǎng)孔中緩慢加入4μl(8μg)siRNA試劑，緩緩晃動(dòng)培養(yǎng)板使其均勻，并加入100U雙抗生素(青霉素/鏈霉素，另設(shè)未加siRNA的空白組和加入無(wú)關(guān)的siRNA作為對(duì)照組。繼續(xù)在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，后用倒置相差熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。24h后半量更換新鮮培養(yǎng)液，48h后收集蟲(chóng)體做后續(xù)驗(yàn)證。

1.4.2 脂質(zhì)體lipo2000轉(zhuǎn)染 轉(zhuǎn)染前將機(jī)械童蟲(chóng)以500條/孔接種24孔板中，添加無(wú)血清新鮮的M169培養(yǎng)基450μl，取EP管分裝30μl的培養(yǎng)基，分別加入8μl LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑，逐滴緩慢加入4μl(8μg) siRNA試劑(實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組)，充分混勻，室溫靜置20min，使其形成轉(zhuǎn)染復(fù)合物。將50μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢逐滴加入培養(yǎng)孔中，并加入100U雙抗生素(青霉素/鏈霉素)，另設(shè)空白對(duì)照一組。繼續(xù)在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，后用倒置相差熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。24h后半量更換新鮮培養(yǎng)液，48h后收集蟲(chóng)體做后續(xù)驗(yàn)證。

1.4.3 電穿孔轉(zhuǎn)染法 根據(jù)機(jī)械童蟲(chóng)操作方法,將收集到的尾蚴斷尾處理成為童蟲(chóng)，培養(yǎng)基清洗童蟲(chóng)重復(fù)3次，離心半徑10cm，3000r/min,離心3min，去盡培養(yǎng)基，加入預(yù)熱好的200μl M169培養(yǎng)基，輕柔地吹打均勻，分別吸取50μl液體至準(zhǔn)備好的無(wú)菌4mm的電擊杯中，緩慢逐滴加入4μl(8μg)siRNA,另設(shè)陰性對(duì)照siRNA組和空白對(duì)照組，電穿孔的參數(shù)設(shè)置為: 電壓125V，時(shí)間20ms，方波電擊一次；電穿孔后，將電擊杯內(nèi)蟲(chóng)體溶液以1000條/孔接種于24孔板中，添加無(wú)血清新鮮的M169培養(yǎng)基450μl，并加入100U雙抗生素(青霉素/鏈霉素)，繼續(xù)在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，后用倒置相差熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。24h后半量更換新鮮培養(yǎng)液，48h后收集蟲(chóng)體做后續(xù)驗(yàn)證。

1.4.4 納米材料聚乙烯亞胺(PEI)轉(zhuǎn)染法 轉(zhuǎn)染前，將機(jī)械童蟲(chóng)以500條/孔接種24孔板中，添加無(wú)血清新鮮的M169培養(yǎng)基450μl，取EP管分裝30μl的培養(yǎng)基，按照N/P(Nitrogen/Phosphate，載體氨基氮/DNA磷酸基)為1/15，逐滴緩慢加入，使其充分混勻，室溫靜置15min，制備成轉(zhuǎn)染復(fù)合物(實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組)，另設(shè)2孔未加納米材料的空白組做對(duì)照。將50μl轉(zhuǎn)染復(fù)合物緩慢逐滴加入培養(yǎng)孔中，并加入100U/ml雙抗生素(青霉素/鏈霉素)。繼續(xù)在5%CO2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h，后用倒置相差熒光顯微鏡觀察細(xì)胞轉(zhuǎn)染率。24h后半量更換新鮮培養(yǎng)液，48h后收集蟲(chóng)體做后續(xù)驗(yàn)證。

1.5 轉(zhuǎn)染效率的測(cè)定

4種不同的方法轉(zhuǎn)染日本血吸蟲(chóng)機(jī)械童12h后，新鮮培養(yǎng)基清洗蟲(chóng)體3次，然后用熒光顯微鏡觀察各孔熒光標(biāo)記的陽(yáng)性蟲(chóng)體數(shù)量，每孔隨機(jī)觀察3個(gè)視野，計(jì)數(shù)發(fā)紅色熒光的蟲(chóng)體占全部蟲(chóng)體的百分率即為轉(zhuǎn)染效率，計(jì)算各種方法在相同條件下的平均轉(zhuǎn)染率。轉(zhuǎn)染效率的計(jì)算方法如下: 轉(zhuǎn)染效率=發(fā)熒光的蟲(chóng)體/相同視野下的蟲(chóng)體數(shù)量×100%。

1.6 實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)靶基因表達(dá)情況

將各轉(zhuǎn)染48h后的蟲(chóng)體收集在1.5ml的EP管中。離心半徑10cm，3000r/min，離心5min，棄培養(yǎng)基，用0.1%PBS洗滌蟲(chóng)體2次后，每管加入200μl TRIZOL試劑(Invitrogen),根據(jù)TRIZOL操作說(shuō)明抽提總RNA。純化后的RNA按照MV-MLV(TAKARA) RT-PCRSystem反應(yīng)體系要求，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。反應(yīng)完成后的cDNA樣品保存于-20℃?zhèn)溆?。根?jù)目的靶基因(未發(fā)表)設(shè)計(jì)引物，通過(guò)Real-Time PCR驗(yàn)證轉(zhuǎn)染的siRNA對(duì)其靶基因的抑制效果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染效率比較

將日本血吸蟲(chóng)機(jī)械童蟲(chóng)轉(zhuǎn)染24h后在相差熒光顯微鏡4倍放大下觀察，圖1為顯微鏡下拍攝的轉(zhuǎn)染后的蟲(chóng)體，帶有紅色熒光的表示轉(zhuǎn)染成功的蟲(chóng)體。空白對(duì)照組孔在熒光相差顯微鏡下未見(jiàn)有紅色熒光。

在同一培養(yǎng)孔中，計(jì)算三個(gè)不同視野下的陽(yáng)性蟲(chóng)體個(gè)數(shù)，計(jì)算轉(zhuǎn)染效率。4種不同方法的轉(zhuǎn)染效率分別為: 浸泡法27%,lipo2000 30.6%,電穿孔91%,納米材料PEI 89%，見(jiàn)圖2。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 浸泡法和脂質(zhì)體lipo2000轉(zhuǎn)染效率較低，電穿孔法和納米材料具有相對(duì)較高的轉(zhuǎn)染效率。

圖1 4種方法轉(zhuǎn)染日本血吸蟲(chóng)機(jī)械童蟲(chóng)siRNA 12h倒置相差顯微鏡下的照片(×4)Fig.1 Inverted fluorescence microscopic views of mechanical schistosomula 12h after siRNA transfection by 4 different methods(×4)A: 體表滲透法轉(zhuǎn)染siRNA 12h后；B: lipo2000轉(zhuǎn)染siRNA 12h后；C: 點(diǎn)穿孔法轉(zhuǎn)染siRNA 12h后；D: PEI轉(zhuǎn)染siRNA 12h后

圖2 4種方法轉(zhuǎn)染siRNA后12h的轉(zhuǎn)染效率Fig.2 Transfection efficiency by four methods 12h after transfection

2.2 轉(zhuǎn)染siRNA后對(duì)靶基因mRNA的抑制

轉(zhuǎn)染siRNA 48h后，收集蟲(chóng)體，0.05% PBS溶液洗滌3次，TRIZOL法抽提總RNA,隨后反轉(zhuǎn)錄為cDNA。實(shí)時(shí)熒光定量Real-Time PCR，檢測(cè)siRNA對(duì)應(yīng)的血吸蟲(chóng)內(nèi)源性基因mRNA的表達(dá)情況，內(nèi)參基因選取日本血吸蟲(chóng)GAPDH的表達(dá)量做為參照，實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于陰性對(duì)照(NC)組對(duì)靶基因的表達(dá)有明顯抑制效應(yīng)的是電穿孔轉(zhuǎn)染法和納米材料PEI轉(zhuǎn)染法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示電穿孔法實(shí)驗(yàn)組相對(duì)于陰性對(duì)照組抑制率為(45±9.63)%(P=0.008)，納米材料PEI轉(zhuǎn)染法的實(shí)驗(yàn)組抑制率達(dá)到(37±6.17)%(P=0.006)。結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 RT-PCR檢測(cè)靶基因的相對(duì)表達(dá)量Fig.3 The relative expression of target gene detected by RT-PCR

3 討 論

目前，RNA干擾技術(shù)已成為生物學(xué)功能研究中的常規(guī)工具，探索一種最佳的轉(zhuǎn)染方法是關(guān)鍵的一個(gè)環(huán)節(jié)[8]。本研究以日本血吸蟲(chóng)機(jī)械童蟲(chóng)為研究對(duì)象，對(duì)比研究了4種轉(zhuǎn)染方法在日本血吸蟲(chóng)機(jī)械童蟲(chóng)中的轉(zhuǎn)染效率和效果，主要參考了國(guó)內(nèi)學(xué)者程國(guó)峰等[9]運(yùn)用化學(xué)合成日本血吸蟲(chóng)抱雌溝蛋白的siRNA分子后,通過(guò)體表滲透法成功地沉默了抱雌溝蛋白的表達(dá)，并表明此干擾特征是劑量依賴(lài)型的。我們的研究也表明，雖然體表滲透法對(duì)血吸蟲(chóng)沒(méi)有任何損傷和毒性，但大劑量的加入siRNA的成本是比較高的，且轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較低。Skelly等[10]為了進(jìn)一步提高siRNA干擾效果，以曼氏血吸蟲(chóng)組織蛋白酶B1為目的靶基因，比較了體表滲透法和電穿孔轉(zhuǎn)染法，以探索最優(yōu)的曼氏血吸蟲(chóng)siRNA干擾條件，驗(yàn)證表明電穿孔法比體表滲透法能更好地導(dǎo)入siRNA分子，基因沉默效果相對(duì)更優(yōu)。本研究的電穿孔法所設(shè)置的參數(shù)參照的是曼氏血吸蟲(chóng)電轉(zhuǎn)染條件[11]，結(jié)果表明電穿孔法轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較高，可達(dá)到90%，但此法對(duì)蟲(chóng)體不可避免地造成了機(jī)械損傷。另外，對(duì)比了脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法和新型納米材料試劑轉(zhuǎn)染法，結(jié)果表明，脂質(zhì)體試劑在血吸蟲(chóng)中的轉(zhuǎn)染效率和效果并不理想，很有可能是血吸蟲(chóng)的生理屏障阻礙了脂質(zhì)體大分子的融入。納米材料在優(yōu)化的濃度下，轉(zhuǎn)染效率相對(duì)較高，但在高劑量情況下，對(duì)蟲(chóng)體有一定的毒性，所以需要優(yōu)化一個(gè)合適的轉(zhuǎn)染劑量，以期在減少毒性的前提下，提高轉(zhuǎn)染效率。

影響轉(zhuǎn)染效率的因素很多，包括物種類(lèi)別、轉(zhuǎn)染時(shí)間、siRNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)染試劑與siRNA的比例等。日本血吸蟲(chóng)的生理結(jié)構(gòu)決定了其轉(zhuǎn)染的困難和限制，至今沒(méi)有穩(wěn)定的細(xì)胞系可供體外研究，機(jī)械童蟲(chóng)為體外轉(zhuǎn)染提供了一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的平臺(tái)，血吸蟲(chóng)的韌密的體被是阻止大分子和帶電荷分子進(jìn)入體內(nèi)的最大屏障。實(shí)驗(yàn)室對(duì)14d童蟲(chóng)也做過(guò)體外的對(duì)比轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染效率比機(jī)械童蟲(chóng)低很多，最高只能達(dá)到20%，這很大可能與血吸蟲(chóng)逐漸增厚的體被有關(guān)，也有可能是通過(guò)物理操作制備的機(jī)械童蟲(chóng)有局部損傷，siRNA更容易被轉(zhuǎn)入體內(nèi)。PEI與siRNA的質(zhì)量比為10∶1～15∶1時(shí)，可以達(dá)到相對(duì)高效低毒，轉(zhuǎn)染后3h就可棄去轉(zhuǎn)染液更換培養(yǎng)液，不會(huì)影響轉(zhuǎn)染效率。日本血吸蟲(chóng)的轉(zhuǎn)染時(shí)間適宜于48h后檢測(cè)，更長(zhǎng)時(shí)間的轉(zhuǎn)染如果不進(jìn)行二次轉(zhuǎn)染，對(duì)血吸蟲(chóng)的轉(zhuǎn)染效果并不一定會(huì)增強(qiáng)，反而可能因?yàn)轶w內(nèi)某些基因的代償作用而有所減弱。

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Efficiency of siRNA transfection intoSchistosomajaponicumschistosomulainvitrowith different methods

ZHAOJing，LINChao，PANWei-qing

(School of Life Sciences and Technology, Tongji University, Shanghai 200092, China)

Objective To compare the efficiency of siRNA transfection toschistosomajaponicumschistosomula in vitro by different methods. Four methods are soaking, electroporation, liposome transfection reagents(LipofectamineTM2000) and nano-materials polyethyleneimine(PEI). Methods “Mechanical schistosomula”were prepared by mechanical transformation ofSchistosomajaponicumcercaria. Chemical-synthesized siRNA with red fluorescent tags was transfected to mechanical-transformed shistosomula by 4 different methods: soaking, electroporation, LipofctamineTM2000 and nano-polyethyleneimine(nano-PEI), respectively. The transfection efficiency was observed by fluorescence microscope, the mRNA expression of target genes was detected by reverse transcription polymerase chain reaction(RT-PCR). Results The transfection efficiency was more than 90% mediated by electroporation and nano-PEI under optimal transfection conditionsinvitro. Target genes had a significant inhibitory effect (P<0.05) with a inhibited rate of (45±9.63)% for electroporation and(37±6.17)% for nano-PEI. Conclusion In addition to the commonly used electroporation, nano-PEI as a new type of transfection vector can effectively transfect the target gene in mechanical-transformed shistosomula ofSchistosomajaponicum.

Schistosomajaponicum; mechanical schistosoma; siRNA; transfection efficiency

10.16118/j.1008-0392.2015.03.001

2014-12-23

國(guó)家“973”重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展計(jì)劃(2007CB513100)

趙 靜(1988—)，女，博士研究生.E-mail: zhj88717@live.cn

潘衛(wèi)慶．E-mail: wqpan0912@aliyun.com

R 73

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1008-0392(2015)03-0001-05