于新友　李天芝　王金良　李　峰　沈志強(qiáng),（山東綠都生物科技有限公司，山東濱州56600；山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州56600）

豬圓環(huán)病毒2型PCR快速檢測(cè)方法的建立

于新友1李天芝1王金良2李峰2沈志強(qiáng)1,2
（1山東綠都生物科技有限公司，山東濱州256600；2山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院，山東濱州256600）

摘要：根據(jù)GenBank公布的豬圓環(huán)病毒2型保守序列設(shè)計(jì)了一對(duì)引物，建立了檢測(cè)豬圓環(huán)病毒2型PCR方法，并對(duì)其特異性、敏感性進(jìn)行了研究。該P(yáng)CR方法對(duì)豬圓環(huán)病毒2型的擴(kuò)增結(jié)果為陽(yáng)性，而對(duì)對(duì)照毒株的擴(kuò)增結(jié)果均為陰性；對(duì)豬圓環(huán)病毒2型檢測(cè)的靈敏度為1 pg總DNA量。以上結(jié)果表明該P(yáng)CR方法特異性強(qiáng)、敏感性高、簡(jiǎn)便、快速，可用于豬圓環(huán)病毒2型的早期確診和病毒鑒定。

關(guān)鍵詞：豬圓環(huán)病毒2型；PCR方法；快速檢測(cè)

豬圓環(huán)病毒依據(jù)其致病性和基因組差異分為無(wú)致病性的豬圓環(huán)病毒1型（Porcine Circovirus 1, PCV1）和有致病性的豬圓環(huán)病毒2型（Porcine Circovirus 2, PCV2），PCV2是引起仔豬斷奶后多系統(tǒng)衰竭綜合征（post -weaning multisyste wasting syndrome, PMWS）[1]的主要病原，此外，PCV2還與豬皮炎與腎炎綜合征（porcine dermatitis andnephropathy syndrome, PDNS）、豬呼吸道綜合征（porcine respiratory disease complex, PRDC）及繁殖障礙以及腸炎等疾病有關(guān)[2]，是一種免疫抑制性疾病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[3-5]。2000年，我國(guó)首次報(bào)道了PCV2感染，目前，PCV2感染在我國(guó)豬群中廣泛存在，種豬有很高的感染率，與其他疾病混合感染的現(xiàn)象嚴(yán)重，臨床上表現(xiàn)為不同的綜合征。

PCV2的傳統(tǒng)檢測(cè)方法有病毒分離、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、免疫熒光法和免疫組化法等，這些方法均有很多缺點(diǎn)，如耗時(shí)長(zhǎng)、檢測(cè)敏感性較低及準(zhǔn)確性差等，尤其不能檢測(cè)亞臨床感染的豬。PCR檢測(cè)方法以檢測(cè)快速、靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于細(xì)菌和病毒的檢測(cè)，并具有良好的應(yīng)用前景。為調(diào)查山東省PCV2的流行情況，本研究根據(jù)GenBank公布的PCV2基因（DQ104423）序列建立了一種特異、敏感的PCV2檢測(cè)方法，并用該法對(duì)采自山東省各地的PCV2疑似病料進(jìn)行檢測(cè)。

1　材料和方法

1.1病毒株與病料

豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）、豬圓環(huán)病毒1型（PCV1）、豬瘟病毒（CSFV）、豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）、豬細(xì)小病毒(PPV)、豬偽狂犬病毒(PRV)及流行性乙型腦炎病毒（JEV）由山東省濱州畜牧獸醫(yī)研究院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)與動(dòng)物生物技術(shù)重點(diǎn)開(kāi)放實(shí)驗(yàn)室保存，臨床疑似病料為2013年10月—2014年11月采自山東省各地豬場(chǎng)臨床診斷為PCV2感染豬的脾臟及淋巴結(jié)等。

1.2工具酶及試劑盒

pMD18-T載體、限制性?xún)?nèi)切酶、PCR相關(guān)試劑、DNA Marker 和DNA凝膠回收試劑盒，購(gòu)自寶生物工程(大連)有限公司；AxyPrep體液病毒DNA小量試劑盒購(gòu)自愛(ài)思進(jìn)生物技術(shù)(杭州)有限公司。

1.3PCR引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中登錄的PCV2基因序列（DQ104423），應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件，設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，擴(kuò)增PCV2的515 bp基因片段。引物在生工生物工程（上海）股份有限公司合成。上游引物：5′-GTGGTTGTTATTGATGAC -3′，下游引物：5′-AATCAGCTTTG GCTGAGGC-3′。

1.4PCV2基因組DNA的提取

按AxyPrep體液病毒DNA小量試劑盒的使用說(shuō)明書(shū)提取PCV2 的DNA，并提取PCV1、CSFV、PRRSV、PPV、PRV、JEV等病毒的核酸。

1.5PCV2的PCR反應(yīng)條件的確立

以提取的PCV2 DNA作為模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，擴(kuò)增。在其他條件不變的情況下，對(duì)反應(yīng)的退火溫度進(jìn)行優(yōu)化，分別采用40、42、44、46、48及50℃6種不同的退火溫度進(jìn)行擴(kuò)增；在其他條件不變的情況下，對(duì)反應(yīng)的引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，分別采用0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、及1.2 μmol/L 6種不同引物濃度進(jìn)行擴(kuò)增。反應(yīng)體系保持為25 μL，PCR反應(yīng)的條件保持不變，為95℃預(yù)變性5分鐘，95℃30秒、46℃30秒，72℃30秒，共30個(gè)循環(huán)，最后72℃延伸10分鐘。

1.6PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)及鑒定

取5 μL PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳檢測(cè)，紫外燈下觀察擴(kuò)增結(jié)果。如果有目的條帶，則切下目的條帶，按照DNA凝膠回收試劑盒的說(shuō)明書(shū)操作，回收目的片段。將回收后的片段與pMD18-T連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)DH5α，37℃過(guò)夜培養(yǎng)后，挑取單菌落搖菌過(guò)夜，按質(zhì)粒提取試劑盒的說(shuō)明書(shū)抽提培養(yǎng)菌液的質(zhì)粒，用建立的PCR方法檢測(cè)質(zhì)粒是否含有。如果含有，將提取的質(zhì)粒發(fā)送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與參照的PCV2基因序列進(jìn)行基因相似性分析。

1.7特異性試驗(yàn)

分別提取PCV2、PCV1、CSFV、PRRSV、PPV、PRV、JEV等7種不同的病毒核酸作為模板，用已建立的PCR檢測(cè)方法進(jìn)行擴(kuò)增。

1.8敏感性試驗(yàn)

提取PCV2基因組DNA，用儀器測(cè)定含量，然后10倍系列稀釋?zhuān)筆CV2基因組DNA的含量分別為10 ng、1 ng、100 pg、10 pg、1 pg 及0.1 pg。分別將其作為模板，用建立的方法分別進(jìn)行PCR檢測(cè)擴(kuò)增，確定PCR檢測(cè)方法的敏感性。

1.9重復(fù)性試驗(yàn)

為了驗(yàn)證所建立PCR檢測(cè)方法的重復(fù)性，分別提取3批PCV2陽(yáng)性病料、陰性病料以及6種陰性對(duì)照病毒如PCV1、CSFV、PRRSV、PPV、PRV及JEV的核酸作為模板，進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)。

1.10臨床樣品的檢測(cè)

提取臨床上送檢的35份PCV2疑似病料的基因組DNA為模板，用建立的PCR檢測(cè)方法擴(kuò)增檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測(cè)

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物，結(jié)果在約515 bp出現(xiàn)目的DNA條帶（圖1），和預(yù)期大小一致。

圖1　PCV2擴(kuò)增結(jié)果

2.2特異性試驗(yàn)

利用所設(shè)計(jì)的引物及所確定的最佳反應(yīng)條件分別對(duì)PCV2、PCV1、CSFV、PRRSV、PPV、PRV和JEV進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果7個(gè)毒株中只有PCV2能擴(kuò)增出相應(yīng)的片段，大小為515 bp(預(yù)期515 bp)，而其他均未擴(kuò)增出相應(yīng)的片段（圖2）。說(shuō)明本研究建立的方法特異性很好。

圖2　特異性試驗(yàn)

2.3敏感性試驗(yàn)

用1.5%瓊脂糖凝膠電泳分別檢測(cè)5 μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，1～5號(hào)樣品產(chǎn)物在515 bp位置均有目的條帶，6號(hào)樣品產(chǎn)物無(wú)擴(kuò)增條帶。結(jié)果顯示，引物的檢測(cè)靈敏度可達(dá)1 pg DNA（圖3）。

圖3　敏感性試驗(yàn)

2.4重復(fù)性試驗(yàn)

重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，3批不同病料的檢測(cè)結(jié)果相同，說(shuō)明建立的PCR檢測(cè)方法重復(fù)性好、可靠、穩(wěn)定。

2.5臨床樣品的檢測(cè)

用建立的方法檢測(cè)的35份臨床疑似PCV2病料中，有10份結(jié)果呈陽(yáng)性。

3　討論

本試驗(yàn)對(duì)GenBank公布的PCV2基因序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)PCV2相對(duì)比較保守，查找出其高度保守區(qū)域，參照GenBank中登錄的PCV2基因序列（DQ104423），利用Primer Premier5.0設(shè)計(jì)1對(duì)引物，通過(guò)PCR擴(kuò)增出目的基因，連接到pMD18-T載體，送樣測(cè)序，對(duì)測(cè)序結(jié)果與模板序列進(jìn)行比對(duì)，其同源性為100%。對(duì)退火溫度優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)只有當(dāng)退火溫度為46℃時(shí)，才能獲得較為理想的產(chǎn)物，其他溫度即使相差2℃也不能獲得理想的試驗(yàn)結(jié)果。對(duì)引物濃度進(jìn)行優(yōu)化，在引物濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0及1.2 μmol/L時(shí)不影響PCR反應(yīng)的擴(kuò)增效率，擴(kuò)增效率相對(duì)較高的引物濃度為0.6μmol/L，擴(kuò)增效率相對(duì)較低的引物濃度為1.2μmol/L。敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，本檢測(cè)方法的靈敏度可以達(dá)到1 pg DNA。本試驗(yàn)所建立的PCV2 PCR檢測(cè)方法能夠擴(kuò)增出515 bp目的片段，而對(duì)常見(jiàn)的豬病病毒，如PCV1、CSFV、PRRSV、PPV、PRV 和JEV均無(wú)擴(kuò)增產(chǎn)物，證明本方法具有很好的特異性。用建立的PCV2 PCR檢測(cè)方法，檢測(cè)35份臨床疑似PCV2病料，檢出10份PCV2陽(yáng)性病料。因此，本試驗(yàn)為PCV2的流行病學(xué)調(diào)查和檢測(cè)提供了一種簡(jiǎn)單、快速和有效的檢測(cè)方法。

參考文獻(xiàn)

[1] Clark EG. Post -weaning multisystemic wasting syndrome [J]. Proceeding of the American Association of Swine Practitioners, 1997(28):499-501.

[2]游一,許保疆,王克領(lǐng),等.規(guī)模化豬場(chǎng)豬圓環(huán)病毒病的診斷及綜合防制[J].中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2009, 36(9):152-154.

[3]殷震,劉景華.動(dòng)物病毒學(xué)[M].第2 版.北京:科學(xué)出版社, 1997:1175-1182.

[4] Harms PA, Sorden SD, Halbur PG. Three cases of porcinerespiratory disease complex associated with porcine circovirustype2 infection [J]. Swine Health and Production, 2002(38):528-539.

[5] Neumann EJ, Dobbinson, Welch EB, et al. Descriptive sum-mary of an outbreak of porcine post -weaning multisystemicwasting syndrome (PMWS) in New Zealand [J]. New Zeal-and Veterinary Journal, 2007 (55):346-352.

中圖分類(lèi)號(hào)：S828.28

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：B

文章編號(hào)：1673-4645(2015)03-0048-03

收稿日期：2014-11-27

基金項(xiàng)目：山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系生豬產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目(SDAIT-06-011-14)

作者簡(jiǎn)介：于新友(1983-)，男，漢族，山東菏澤人，助理研究員，碩士，主要從事動(dòng)物傳染病診斷技術(shù)研究，Email:yuxinyou_2006@126.com