王 濤

血小板膜受體P2Y12基因多態(tài)性與冠心病患者氯吡格雷抵抗的相關(guān)性研究

王 濤

目的研究血小板膜受體P2Y12(C34T、G52T、i744TC)基因的遺傳多態(tài)性與冠心病患者氯吡格雷抵抗間的關(guān)系。方法選取50例2012年1月—2013年8月就診于我院的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病患者為病例組,其中15例患者接受完整氯吡格雷治療,將其設(shè)為治療組;另選取健康人群16名為對(duì)照組。應(yīng)用多聚酶鏈-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)對(duì)所有參與者檢測(cè)P2Y12受體基因(C34T、G52T、i744TC)的多態(tài)性分布頻率進(jìn)行檢測(cè),比較治療組基因型與氯吡格雷抵抗之間的關(guān)系。結(jié)果所有參與者血小板膜受體P2Y12基因的突變位點(diǎn)C34T、G52T及i744TC等位基因分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡法則(P>0.05),樣本人群具有代表性。對(duì)于15例接受完整氯吡格雷治療的患者分析結(jié)果顯示:治療后血小板聚集率降低幅度為(15.37± 10.41)%,對(duì)治療組全部成員進(jìn)行C34T、G52T、iT744C基因分型,其中C34T中CC型6例、CT型4例、TT型5例,氯吡格雷抵抗發(fā)生率由低到高為:CC型33.33%(2/6)、CT型50%(2/4)、TT型60%(3/5);G52T不同基因分型患者血小板聚集率在治療后下降幅度和氯吡格雷抵抗發(fā)生率之間差別無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;iT744C基因型中CC型患者其治療后血小板聚集率降低程度、實(shí)驗(yàn)室氯吡格雷抵抗發(fā)生率均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論冠心病患者發(fā)生氯吡格雷抵抗可能與C34T C>T的突變有關(guān);G52T的基因突變與氯吡格雷抵抗的發(fā)生無(wú)關(guān);iT744C CC型基因可能與實(shí)驗(yàn)室氯吡格雷抵抗有關(guān)。

冠心病;血小板膜受體P2Y12;基因多態(tài)性;氯吡格雷抵抗

由于冠狀動(dòng)脈介入治療在急性冠脈綜合征(ACS)中的廣泛應(yīng)用,抗凝及抗血小板藥物在治療變異性心絞痛和急性心肌梗死中的作用也日益顯著[1,2]。氯吡格雷是一種新型噻吩吡啶類(lèi)藥物,它作為血小板膜ADP受體拮抗劑,通過(guò)阻礙ADP與血小板膜受體結(jié)合,達(dá)到抑制血小板聚集的目的,同時(shí)還可以阻斷激活后的級(jí)聯(lián)放大效應(yīng)[3]。既往研究表明[4],長(zhǎng)期使用氯吡格雷可顯著降低患者經(jīng)皮冠狀動(dòng)脈介入治療(PCI)后血栓形成的發(fā)生率。但是近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn), PCI術(shù)后患者對(duì)氯吡格雷的臨床反應(yīng)存在個(gè)體性差異,即使接受完整的氯吡格雷治療,不良心血管事件仍有發(fā)生。這種現(xiàn)象的具體原因尚不清楚。由于血小板膜受體P2Y12在氯吡格雷藥理過(guò)程中發(fā)揮重要作用,所以有研究認(rèn)為P2Y12基因多態(tài)性可能與氯吡格雷抵抗有關(guān)[5]。本研究擬通過(guò)對(duì)中國(guó)人血小板膜受體P2Y12基因C34T、G52T、i744TC多態(tài)性位點(diǎn)進(jìn)行分析,以進(jìn)一步了解P2Y12基因與氯吡格雷抵抗之間的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2012年1月—2013年8月就診于我院心血管內(nèi)科的50例冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病(CHD)患者為病例組,男27例,女23例,年齡(62.37±13.59)歲。其中15例患者接受完整氯吡格雷治療,設(shè)為治療組。病例入選標(biāo)準(zhǔn):中國(guó)漢族人,18歲以上,冠狀動(dòng)脈造影檢查確診為CHD;排除嚴(yán)重心功能不全、患有嚴(yán)重肝臟疾病和或凝血功能障礙者;半年內(nèi)有卒中或內(nèi)臟出血性疾病病史者。治療組患者口服氯吡格雷75 mg,每日一次維持治療至少12個(gè)月。另隨機(jī)選擇同期參加本地區(qū)CHD疾病篩查的健康人群1 6名為對(duì)照組,漢族,男9名,女7名,年齡(57.24±11.35)歲。實(shí)驗(yàn)室氯吡格雷抵抗試驗(yàn):服用氯吡格雷前及服用10 d后監(jiān)測(cè)血小板聚集率,即用5 μmol/L和20μmol/L的ADP作為聚集誘導(dǎo)劑來(lái)誘導(dǎo)血小板聚集時(shí),受試者服用氯吡格雷后達(dá)到最大血小板抑制率與基線相比<10%為抵抗,10%～29%為半抵抗。

1.2 研究方法 對(duì)所有研究對(duì)象告知研究相關(guān)事宜,并自愿簽署知情同意書(shū)。取所有參與者外周靜脈血5 mL,經(jīng)EDTA抗凝處理并保存,用于基因組DNA的提取。使用氯仿抽提法提取白細(xì)胞基因組DNA,置于-20℃環(huán)境中保存。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性(PCR-RFLP)法對(duì)樣本基因C34T、G52T及iT744C進(jìn)行分型分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 樣本群體代表性采用Hardy-Weinberg遺傳法則檢驗(yàn)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示,兩組間數(shù)據(jù)比較采用t檢驗(yàn),基因型和等位基因頻率的比較用百分比表示,率的比較使用χ2檢驗(yàn)。所有數(shù)據(jù)結(jié)果均采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,以P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

全部參試人員P2Y12基因三種基因型分布符合Hardy-Weinberg遺傳平衡(P>0.05),說(shuō)明樣本來(lái)自一個(gè)較大的且處于隨機(jī)平衡狀態(tài)的群體,具有一定代表性。

2.1 病例組基本資料(見(jiàn)表1～3)

表1 P2Y12基因C34T多態(tài)性位點(diǎn)基因型和等位基因頻率比較

表3 兩組P2Y12基因i744TC多態(tài)性位點(diǎn)的比較

表2 兩組P2Y12基因G52T多態(tài)性位點(diǎn)比較

2.2 治療組15例口服氯吡格雷患者資料 ①使用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)C34T成功分型15例,CC型8例、CT型5例、TT型2例,各基因分型間服用氯吡格雷前后比較,最大血小板聚集率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),服用氯吡格雷10 d后最大血小板聚集率下降顯著(P<0.05);C34T各基因型間實(shí)驗(yàn)室抵抗發(fā)生率分別為:CC型62.5%(5/8),CT型60.0% (3/5),TT型50.0%(1/2),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)(詳見(jiàn)表4、表5)。

表4 治療組患者C34T各基因型間最大血小板聚集率的比較(±s)%

指標(biāo)CC(8/15)CT(5/15)TT(2/15)F值P服藥前最大血小板聚集率55.73±13.4162.11±13.9757.65±10.381.1070.471服藥后最大血小板聚集率42.64±12.1947.18±10.7753.27±11.544.5930.051血小板聚集率降低幅度14.78±11.1313.74±10.954.51±3.475.0370.011

表5 治療組患者實(shí)驗(yàn)室氯吡格雷抵抗情況在C34T各基因型間的比較

②使用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)G52T成功分型15例,GG型9例、GT型3例、TT型3例,各基因分型間服用氯吡格雷前后比較,最大血小板聚集率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),服用氯吡格雷10 d后最大血小板聚集率無(wú)明顯變化(P>0.05);G52T各基因型間實(shí)驗(yàn)室抵抗發(fā)生率分別為:GG型44.44%(4/9),GT型33.33%(1/3),TT型66.67%(2/3),差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見(jiàn)表6、表7。

表6 治療組患者G52T各基因型間最大血小板聚集率的比較(±s)%

表6 治療組患者G52T各基因型間最大血小板聚集率的比較(±s)%

指標(biāo)GT(9/15)GT(3/15)TT(3/15)F值P服藥前最大血小板聚集率58.61±13.6760.11±13.9552.23±9.500.5220.723服藥后最大血小板聚集率43.82±13.3143.07±10.9145.13±17.440.3510.631血小板聚集率降低幅度10.96±13.5414.64±11.0615.26±10.240.2830.536

表7 治療組患者實(shí)驗(yàn)室氯吡格雷抵抗情況在G52T各基因型間的比較

③使用PCR-RFLP技術(shù)對(duì)iT744C成功分型15例,TT型7例、TC型6例、CC型2例,各基因型間服用氯吡格雷前最大血小板聚集率、服用氯吡格雷10 d后最大血小板聚集率、服藥前后血小板聚集率降低幅度在各基因型間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05); iT744C不同基因型患者治療后基因型與實(shí)驗(yàn)室氯吡格雷抵抗發(fā)生率之間的差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P< 0.05)。詳見(jiàn)表8、9。

表7 治療組患者iT744C各基因型間最大血小板聚集率的比較(±s)%

表7 治療組患者iT744C各基因型間最大血小板聚集率的比較(±s)%

指標(biāo)TT(7/15)TC(6/15)CC(2/15)F值P服藥前最大血小板聚集率58.32±17.5661.77±15.2356.76±8.711.0870.032服藥后最大血小板聚集率45.75±11.2944.14±12.0749.14±9.414.4210.015血小板聚集率降低幅度12.01±13.3114.91±11.316.78±5.864.8720.001

表8 治療組患者實(shí)驗(yàn)室氯吡格雷抵抗情況在iT744C各基因型間的比較

3 討 論

氯吡格雷作為一種新型噻吩吡啶藥物,通過(guò)抑制ADP與血小板膜上的ADP受體結(jié)合發(fā)揮抗血小板聚集作用。氯吡格雷是一個(gè)前體藥物,本身無(wú)生物活性,進(jìn)入肝臟后通過(guò)細(xì)胞色素P450酶系統(tǒng)(CYP450)中的CYP3A4和CYP3A5代謝,通過(guò)2次氧化形成一個(gè)含有二硫鍵的有生物活性代謝產(chǎn)物,這個(gè)代謝產(chǎn)物可不可逆的阻礙血小板膜上ADP受體與ADP結(jié)合。大量臨床實(shí)驗(yàn)證明[3],常用劑量的氯吡格雷可使血小板聚集率降低50%,且其抗血小板聚集作用與藥物時(shí)間和劑量相關(guān)。但氯吡格雷抵抗現(xiàn)象從最初應(yīng)用氯吡格雷治療CHD就存在,一些患者在使用氯吡格雷后仍有血栓栓塞事件發(fā)生[6]。關(guān)于氯吡格雷抵抗產(chǎn)生機(jī)制,目前認(rèn)為與血小板膜受體基因P2Y12多態(tài)性有關(guān)[7-9]。P2Y12基因位于人類(lèi)3號(hào)染色體q24-25上,現(xiàn)有研究已證實(shí)[1014],P2Y12基因位點(diǎn)的突變可引起P2Y12受體蛋白氨基酸AMPD的改變,從而改變P2Y12受體結(jié)構(gòu)進(jìn)而影響P2Y12受體的激活。P2Y12受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體,它作為噻吩吡啶類(lèi)藥物的作用位點(diǎn),有(P2Y1、P2Y12)2種亞型。P2Y12受體激活后,不僅引發(fā)ADP誘導(dǎo)的血小板構(gòu)象改變從而發(fā)生血小板聚集,再經(jīng)由腺苷酸環(huán)化酶抑制蛋白旁路,放大Gq效應(yīng);而且使ADP介導(dǎo)的血小板膜GP1b/Ⅲ復(fù)合物活化進(jìn)一步引起血小板聚集。由此可知,P2Y12受體基因的改變,可導(dǎo)致氯吡格雷的抗血小板聚集作用下降,產(chǎn)生氯吡格雷抵抗。目前國(guó)際上普遍較為認(rèn)可的氯吡格雷抵抗標(biāo)準(zhǔn)是:使用百分比計(jì)算血小板聚集率,用5μmol/L ADP作誘導(dǎo)劑,測(cè)定口服氯吡格雷前后10 d的血小板聚集率最大值的差值≤10%,視為存在實(shí)驗(yàn)室氯吡格雷抵抗[15,16]。

本研究對(duì)CHD組及對(duì)照組進(jìn)行氯吡格雷抵抗試驗(yàn),以及對(duì)C34T、G52T、iT744C基因多態(tài)性的研究發(fā)現(xiàn):C34T成功分為CC型、CT和TT型,各基因分型間服用氯吡格雷前后最大血小板聚集率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,CC型個(gè)體氯吡格雷治療后血小板聚集率降低幅度最大(14.78±11.13)%,并且CC型實(shí)驗(yàn)室抵抗發(fā)生率最高為62.5%。所以認(rèn)為C34T C>T的突變可能是導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)室氯吡格雷抵抗的危險(xiǎn)因素。G52T成功分型為GG、GT和TT型,各基因分型間服用氯吡格雷前后比較,最大血小板聚集率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,服用氯吡格雷治療后血小板聚集率降低幅度無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,并且各基因型間實(shí)驗(yàn)室抵抗發(fā)生率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明G52T G>T的突變與發(fā)生實(shí)驗(yàn)室氯吡格雷抵抗沒(méi)有相關(guān)性。

本研究對(duì)iT744C成功分型TT、TC和CC型,各基因型間服用氯吡格雷前最大血小板聚集率、服用氯吡格雷10 d后最大血小板聚集率、服藥前后血小板聚集率降低幅度在各基因型間差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義, iT744C TT、iT744C TC個(gè)體治療后血小板聚集率下降幅度分別為(12.01±13.31)%、(14.91±11.31)%, iT744C CC個(gè)體最低為(6.78±5.86)%。認(rèn)為iT744C T>C的突變可能會(huì)引起實(shí)驗(yàn)室氯吡格雷抵抗的發(fā)生。

血小板膜P2Y12受體基因C34T C>T及iT744C T>C基因突變可能與冠心病患者發(fā)生氯吡格雷抵抗相關(guān)。但鑒于樣本量太小,需進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行定性定量的研究。

[1] Yusuf S,Bijstervld NR,Moons AH.Effects of clopidogrel in add-i tion to aspirincin patients with acute coronary syndromes without ST-segment elevation[J].N Engl J Med,2001,345(7):494-502.

[2] Selwyn AP.Prothrombotic and antithrombotic pathways in acute coronary syndromes[J].Am Cardiol,2003,91(12):3-11.

[3] 黃振華.氯吡格雷抵抗[J].中國(guó)新藥與臨床雜志,2007,26(9): 695-698.

[4] 王白鴿.氯吡格雷治療冠心病的療效及安全性[J].中國(guó)保健營(yíng)養(yǎng),2013,23(3):1435.

[5] 郝盼盼,陳玉國(guó),張運(yùn),等.氯吡格雷抵抗相關(guān)因素的研究進(jìn)展[J].心血管病學(xué)進(jìn)展,2009,30(6):991-994.

[6] Wiviott SD,Antman EM.Clopidogrel resistance a new chapter in a fast-moving story[J].Circulation,2004,109(25):3064-3067.

[7] Morel O,Ohlmann P,Jesel L,et al.Variable extent of platelet responsiveness to clopidogrel inhibition:“clopidogrel resistance”

[8] Matetzky S,Shenkman B,Guetta V,et al.Clopidogrel resistance is associated with increased risk of recurrent atherothrombotic events in patients with acute myocardial infarction[J].Circulation,2004,109(25):3171-3175.

[9] Wenaweser P,D?rffler-Melly J,Imboden K,et al.Stent thrombosis is associated with an impaired response to antiplatelet therapy[J].Am College Cardiology,2005,45(11):1748-1752.

[10] Mobley JE,Bresee SJ,Wortham DC,et al.Frequency of nonresponse antiplatelet activity of clopidogrel during pretreatment for cardiac catheterization[J].Am J Cardiol,2004,93(4):456-458.

[11] 白艷艷,王長(zhǎng)謙,黃紅漫,等.氯吡格雷抵抗和冠心病患者PCI術(shù)后心血管事件的關(guān)系[J].心血管康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志,2008,17(2):45-48.

[12] Fontana P,Dupont A,Gandrille S,et al.Adenosine diphosphateinduced platelet aggregation is associated with P2Y12 gene sequence variations in healthy subjects[J].Circulation,2003,108 (8):989-995.

[13] Angiolillo DJ,Fernández-Ortiz A,Bernardo E,et al.High clop-i dogrel loading dose during coronary stenting:Effects on drug response and interindividual variability[J].Eur Heart J,2004,25 (21):1903-1910.

[14] Von Beckerath N,Taubert D,Pogatsa-Murray G,et al.Absorption,Metabolization,and Antiplatelet Effects of 300-,600-,and 900-mg Loading Doses of Clopidogrel Results of the ISARCHOICE(Intracoronary Stenting and Antithrombotic Regimen: Choose Between 3 High Oral Doses for Immediate Clopidogrel Effect)Trial[J].Circulation,2005,112(19):2946-2950.

[15] 孟曉冬,王燕慧.氯吡格雷抵抗研究的新分歧[J].國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志,2013,34(15):1990-1992.

[16] 張永珍,高煒.氯吡格雷抵抗的機(jī)制與對(duì)策[J].中華內(nèi)科雜志, 2006,45(3):250-252.

R541 R256

:Bdoi:10.3969/j.issn.1672-1349.2015.03.031

:1672-1349(2015)03-0353-04

2014-07-25)

(本文編輯王雅潔)

廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院(廣州510120)